מאמר שיטה

שימור מורכבות רקמה In Vivo במודל של מערכת עצבים ריחית בעכברים באמצעות אנליזת Whole-Mount למחקר של רגנרציה עצבית

DOI:

10.3791/72036

⸱

18 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתווה זרימת עבודה מלאה לשימור המורכבות האנטומית של מערכת העצבים הריחית בעכבר. כאן פירטנו את זרימת העבודה המלאה, הכוללת ניתוח, הכנת רקמה ודימוי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את מערכת הריח בתנאים נורמליים או חריגים, כולל תנאי תיקון טבעיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעידן של דימות תלת-ממדי (3D), ההבנה כי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית היא מוגבלת ביותר במחקרים של פתולוגיה ואנטומיה אנושית מורכבת הפכה למקובלת. בשל ניתוח של פרוסות צרות בלבד, מבנים גדולים יותר והיבטים חיוניים של ארכיטקטורת הרקמה עלולים לאבד פרטי הקשר קריטיים, מה שמוביל לפרשנויות חלקיות או מטעות. בעוד שחתכים דו-ממדיים (2D) תמכו בהבנה בסיסית של ההיסטו-ארכיטקטורה, הם אינם מספיקים כדי ללכוד את המציאות התלת-ממדית האמיתית של רקמות ביולוגיות.

מספר גדל והולך של מחקרים באזורים אנטומיים מרובים מאמצים כיום טכניקות המבודדות יחידות אנטומיות שלמות - הכנות מסוג flat mount, whole-mount או en face - בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. גישות אלו מציעות ויזואליזציה ופרשנות מקיפות יותר של הארגון המבני. דבר זה משמעותי במיוחד במערכת העצבים האולפקטורית, שבה הגדרת מנגנונים תאיים מורכבים העומדים בבסיס יכולת ההתחדשות המדהימה שלה דורשת הקשר של עובי מלא. בחתכים דקים קיים סיכון להחמיץ מאפיינים פתופיזיולוגיים מרכזיים שנותרו פחות מוגדרים.

נוכח מגבלות אלו והפער בידע בנוגע לאינטראקציות התאיות המניעות את התחדשות רירית האף, היה חיוני לפתח טכניקה מעודנת של צביעת דגימות שלמות (whole-mount), המסוגלת לשמר את מורכבות הרקמה במלוא עוביה. ריריות אף שלמות בודדו כדגימות בעובי מלא, בליווי פרוטוקול מותאם לחדירת נוגדנים. דימות ברזולוציה גבוהה (EVIDENT SpinSR) ושחזור תלת-ממדי אפשרו ויזואליזציה מדויקת של אינטראקציות תאיות in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים הריחית (ONS) מהווה מודל ייחודי ומבוסס לחקר מנגנונים של התחדשות עצבית, שכן היא שומרת על יכולת ייחודית לתחלופה נוירונלית לאורך כל החיים1. עם זאת, הפוטנציאל לתרגום קליני של יכולת תיקון עצבית זו נותר מוגבל בשל פערים משמעותיים בהבנתנו את התנהגות התאים במערכת הריחית2,3,4. התגובות התאיות והארגון האנטומי של ה-ONS, כולל נוירונים ריחיתיים ראשוניים, תאי מעטפת ריחיתיים (OECs) ופיברובלסטים פרי-נוירונליים, תוארו במספר מחקרי בעלי חיים, אשר התבססו על חיתוך רקמה דק מאוד (<2 µm) בשילוב עם מודלים של פגיעה פיזית חמורה שיושמו ב-ONS של מכרסמים1,2. בעלי החיים במחקרים אלה הומתסו בדרך כלל 10 ימים לאחר הפגיעה, מה שסיפק חלון צפייה קטן לרגע ספציפי אחד בלבד של העיצוב מחדש הנרחב והמורכב יותר של רקמה כזו במהלך פגיעה עצבית2. מחקרים אלו דיווחו כי לאחר מוות אקסונלי, תאי OECs ופיברובלסטים נשמרים כתעלות רציפות בעקבות הפגיעה.

למרות היותה אינפורמטיבית, בשל המגבלות הרבות שהוסברו לעיל, הגישה שבה נעשה שימוש סיפקה סקירה רעיונית ברזולוציה נמוכה ובמישור שטחי של ה-ONS, ובסופו של דבר מנעה הערכה מקיפה של הארגון התאי הממשי בתוך ה-ONS השלם3. כתוצאה מכך, ייתכן שקשרים מרחביים קריטיים נעלמו מהעין.

שימור מבנה רקמה תלת-ממדי חיוני לצורך ניתוח אנטומי ותאי מדויק, ויושם בהצלחה במגוון איברים ופתולוגיות4,5,6,7,8,9,10,11,12. גישות של whole‑mount שימשו למיפוי הארגון העצבי בתוך הרירית האפית13,14, עם זאת, ויזואליזציה של אינטראקציות תאיות עם מבנה ONS בעובי מלא, כולל lamina propria משומרת, טרם בוצעה.

במחקר זה, אנו מבססים סבב עבודה באמצעות מודל עכבר הכולל עיבוד רקמה בשיטת whole‑mount, צביעה אימונוהיסטוכימית, דימוי ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת-ממדי, המאפשרים ניתוח מפורט של ארכיטקטורת ה-ONS. פרוטוקול זה פותח כדי למלא את הפער בשיטות המפורסמות הקיימות, כאשר הפרוטוקול שומר ומגונן על רירית אולפקטורית בעובי מלא, כולל את ה-lamina propria, ובכך מאפשר את חקר האינטראקציות הבינתאיות. ראוי לציין כי מתודולוגיה מזוקקת זו של איסוף ועיבוד רקמות יכולה להיות מיושמת ולהיות משולבת עם מודלים שונים של מערכת הריח.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים שכללו בעלי חיים ותאים שעברו שינוי גנטי בוצעו באישור ועדת הבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Griffith (NLRD/003/2020_var3) וועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת Griffith (MHIQ/04/23/AEC), בהתאם להנחיות הרגולטור של המשרד לטכנולוגיית גנים של কমনוולת' אוסטרליה (OGTR).

הערה: במחקר נעשה שימוש ב-15 עכברי מעבדה בוגרים (8–9 שבועות) משני המינים. באופן ספציפי, נעשה שימוש בעכברים טרנסגניים S100β-DsRed שבהם כל ה-OECs מבטאים את החלבון האדום הזוהר DsRed תחת בקרתו של הפרומוטור S100β. S100β הוא חלק ממשפחה רחבה יותר של חלבונים קושרי סידן, והוא מבטא בדרך כלל בתאי גליא במערכת העצבים המרכזית, כגון OECs. מודל זה היה אופטימלי למטרות ניסויים אלו שכן הוא אפשר לוקליזציה קלה של אוכלוסיות תאי המטרה באמצעות אותות פלואורסצנציה אנדוגניים. העכברים הטרנסגניים S100β-DsRed נוצרו בעבר, ונמצא כי השימוש בעכברים טרנסגניים אלו מספק זיהוי משופר של OECs בהשוואה לאימונוהיסטוכימיה עבור אנליזות של רקמה מקובעת15,16,17,18.

1. איסוף ראשים וקיבוע רקמות

  1. יש להקלי את בעלי החיים באמצעות שאיפת CO2 עולה בנקודות הזמן הניסיוניות.
  2. יש לוודא כי המוות אושר על ידי היעדר רפלקס של קרנית ורפלקס נסיגה של הכף, ולאחר מכן לבצע פריקה צווארית, או בהתאם ל-SOP המאושר.
  3. הסר את הראש והלסתות במלואם באמצעות מספריים.
  4. הסר את העור מהגולגולת ואת הסחוס בקצה האף כדי לחשוף את חלל האף ולהבטיח חדירה יעילה של חומר הקיבוע.
    הערה: נצפה כי שלב זה של חיתוך החלק הפרונטלי ביותר של סחוס האף של בעל החיים הוא קריטי כדי לאפשר קיבוע נכון של הרקמה בתוך חלל האף.
  5. שטוף במהירות את הראשים ב-PBS 1× כדי להסיר עודפי דם.
  6. קבע את הרקמה על ידי טבילה למשך לילה (12–18 h) ב-4% paraformaldehyde, למשך 6 h לפחות (זמן מספיק לקיבוע הרקמה הרלוונטית), בטמפרטורה של 4 °C על גלגלת (roller).
    זהירות: Paraformaldehyde הוא כימיקלי מסוכן הפולט אדי פורמלדהיד. הוא רעיל בשאיפה, במגע עם העור ובבליעה; גורם לגירוי בעיניים, בעור ובדרכי הנשימה; ונחשב לחומר מסרטן. יש לטפל בו אך ורק במנדף כימיים תוךneath לבישת PPE מתאימה, הכוללת כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים. פינוי בטוח של כימיקלים מסוכנים ופסולת ביולוגית הנוצרת במהלך הפרוטוקול חייב להתבצע בהתאם לתקנות המוסדיות והמקומיות.
    ​הערה: במהלך אופטימיזציות, צפינו כי 6 h הספיקו לקיבוע הרקמה הרלוונטית; עם זאת, זמן של יותר מ-12 h עלול היה לגרום לקיבוע יתר ולדגרדציה של מבני הרירית.
  7. הוצא את הראשים מחומר הקיבוע ושטוף אותם במשך 3 h ב-PBS 1× בטמפרטורת החדר (20–25 °C) על גלגלת.
  8. אחסן את הראשים ב-PBS טרי ב-4 °C ואסוף את רקמת הרירית בשיטת whole-mount בתוך 48 h.

2. איסוף רקמות בשיטת Whole-mount

  1. בצע בידוד רקמה תחת מיקרוסקופ.
  2. חתכו את הראשים לחצאים באמצעות סקלפל, בהתאם לקו הסגיטלי המרכזי.
  3. חשוף את החלק הפנימי של חלל האף (איור 1). זהו את האזורים האנטומיים ואסוף את רקמת הרירית המצפה את כל המקטע האנטומי (איור 1B).
  4. באמצעות קוצץ עצם, שברו והסירו בעדינות את עצם המחיצה המכסה חלק מחלל הרירית.
    הערה: ראו איור 2Aשלב זה הוא קריטי כדי לחשוף את החלל הקעור שמתחת לעצם, שבו צרורות האקסונים עוברים דרך הדופן הגבנית (איור 1B).
  5. לאחר ששטח זה נחשף, השתמשו בפינצטה קמורה כדי לנתק בעדינות ולהוציא את הרקמה מהדופן הגבית הקעורה. הרימו את הרקמה מהעצם שמתחתיה וקלפו בעדינות את רירית האף שנותרה כדי לאסוף את הדגימה השלמה (whole-mount).
    הערה: בשלב זה נדרשת זהירות רבה כדי למנוע קריעה של הרקמה.
  6. אספו את הרקמה הרלוונטית משתי הנחיריים, ימין ושמאל: הרירית המכסה את המחיצה, את הדפנות הגבּיות הימנית והשמאלית, ואת הרצפת המסננת (cribriform plate) של חלל האף (איור 1A, ב)אסוף רקמה משתי הנחיריים, כולל המחיצה, הדפנות הגבייות והלוח הנחורי (cribriform plate), כדי לבודד את האזור האנטומי המכיל את מבני הריח הראשוניים (איור 2C).
  7. שטפו את הרקמות שנאספו ב-PBS 1× והסירו רקמות מיותרות, כולל שברי עצם. אחסנו את הרקמות ב-PBS 1× בטמפרטורה של 4 °C לצורך ניתוח אימונוהיסטוכימי עתידי.
    הערה: אם הרקמה תועבר לאחסון לטווח ארוך, מומלץ לאחסנה בתמיסת PBS 1× ו-0.001% (משקל/נפח) Sodium Azide, בטמפרטורה של 4 °C.

3. פרוטוקול צביעה מותאם

הערה: פרוטוקולי צביעה נפוצים מותאמים בדרך כלל לחתכים בעובי דק עד בינוני (למשל, עד 50 µm). לפיכך, היה צורך להתאים את הפרוטוקול לרקמה העבה בהרבה.
​נצפה כי שלב מכריע כולל השארת הרקמה לצוף בתוך מבחנות Eppendorf לאורך כל תהליך הצביעה והנחת המבחנות על גלגלת (roller) בזמן חדירת הריאגנטים. לפיכך, שלבי הצביעה לא בוצעו כאשר הרקמה נמצאת על זכוכית ביקורת (imaging slide). הרקמה נצבעה תחילה בעודה צפה, ורק לאחר מכן הועמדה על זכוכיות ביקורת. פרטים אלה הבטיחו שהרקמה לא תתקפל, ושהריאגנטים והנוגדנים יוכלו לחדור לכל האזור.

  1. הוצא את הרקמות מהאחסון והעבר אותן לשפופרת Eppendorf עם תמיסת חסימה (התמיסה שתשמש תהיה ספציפית לסוג הצביעה).
    ​הערה: תמיסת חסימה: 3% BSA, 0.3% Triton X-100 ב-PBS. התאמה חשובה נוספת הייתה הזמן שבו הרקמה נחשפה לכל ריאגנט ולתערובת הנוגדנים.
  2. השאר את הרקמה בתמיסת החסימה למשך 3 h בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב (roller).
    הערה: נצפה כי לא היה צורך להעלות את ריכוז הנוגדנים שנבחרו וריאגנטי הצביעה (Table 1) אם הגדלנו את זמן החשיפה שלהם בהשוואה לגישת צביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית של חתכים דקים. דבר זה צמצם גם את השימוש בריאגנטי נוגדנים יקרים. האינקובציות מבוצעות בשפופרת Eppendorf של 1.5 mL כאשר תפס המכסה גזור, כדי שתוכל להתגלגל על גלגל הסיבוב. נפח הריאגנט היה 500 µL.
  3. בצע אינקובציה למשך 72 h ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים על גלגל סיבוב.
  4. שטוף את הרקמה פעמיים (1.5 h לכל שטיפה) באמצעות PBS 1× בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב.
  5. בצע אינקובציה של הרקמה עם נוגדן משני (עטופה בנייר אלומיניום) וצביעת גרעינים למשך 4 h לפחות בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב, ולאחר מכן העבר לאינקובציה למשך לילה (12–18 h) ב-4 °C על גלגל סיבוב.
  6. שטוף את הרקמה פעמיים (1.5 h בכל פעם) באמצעות PBS 1× בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב.

4. הכנת סלייד

  1. הוצא בעדינות את הרקמה משפופרת ה-Eppendorf
  2. מתחת למיקרוסקופ, הנח את הרקמה על תבנית זכוכית וודא שאין קיפולים ברקמה.
    הערה: ניתן לזהות תחת המיקרוסקופ, ללא פלואורסצנציה, את כיוון הרקמה. יש להניח את צד ה-lamina propria של הרקמה הרירית על התבנית, כך שהאפיתל פונה כלפי זכוכית התבנית וה-lamina propria פונה כלפי זכוכית המכסה. ניתן לזהות את ה-lamina propria על ידי נוכחותם של צרורות עצבים עבים, הנראים ללא צביעה. מיקום הרקמה כך שה-lamina propria פונה לצד זכוכית המכסה והצד האפיתלי מונח על זכוכית התבנית, יקל על תהליכי הצביעה והדמיה.
  3. כסה את התבניות באמצעות מדיום קיבוע פלואורסצנטי ואטום אותן.
  4. ניתן לאחסן את התבניות בטמפרטורה של 4 °C, לאחר ייבוש למשך לילה (12–18 h) בחושך ובטמפרטורת החדר

5. רכישת תמונות ועיבוד לאחר צילום

  1. רכישת תמונות אימונופלואורסצנטיות בהגדלה נמוכה
    1. בצע תפירה אוטומטית (stitching) במהלך רכישת התמונות באמצעות linear alpha-blending.
      ​הערה: יש להתאים את מספר הפריימים ב-z-stack לעובי הדגימה כדי להבטיח כיסוי מלא של נפח הרקמה.
    2. דגום שדות ראייה סמוכים עם חפיפה של 15%. רכוש תמונות בשיטת אריחים (tiled images) באמצעות תבנית רכישה מסוג meander.
    3. התאם את המספר הכולל של החתכים האופטיים לעובי הרקמה.
    4. הגדר את כיול התמונה ל-215.594 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y. רכוש את התמונות כ-z-stacks עם גודל צעד (z-step) של 0.8 µm.
    5. הנח את הרקמה המורכבת (whole-mount) עלבמה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי. רכוש תמונות סקירה באמצעות עדשת אובייקטיב 30x (NA 1.04).
  2. רכישת תמונות אימונופלואורסצנטיות בהגדלה גבוהה.
    1. רכוש תמונות מפורטות באמצעות עדשת אובייקטיב 60× (NA 1.5). הגדר את כיול התמונה ל-107.923 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y. רכוש תמונות z-stack עם גודל צעד (z-step) של 0.41 µm.
    2. התאם את המספר הכולל של החתכים האופטיים לעובי הרקמה, ודגום תמונות משדה ראייה בודד.
      ​הערה: אין צורך בתפירת תמונות עבור רכישות ב-60× מכיוון שכל סט נתונים מורכב משדה ראייה בודד.
  3. רכישת תמונות ייחוס היסטולוגיות
    1. דמיין חתכים סגיטליים מרכזיים של ראש עכבר הצבועים ב-HE באמצעות מיקרוסקופ לסריקת סליידים תחת תאורה בשדה בהיר (brightfield).
    2. רכוש תמונות באמצעות עדשת אובייקטיב 40× (NA 0.95) והגדלת מצלמה של 0.63x, מה שיוביל להגדלה אפקטיבית של 25.2×.
    3. אשר כיול פיקסלים של 136.905 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y, ורכוש את התמונה כמישור מוקד בודד.
    4. תפר תמונות בשיטת אריחים באופן אוטומטי באמצעות תבנית רכישה מסוג meander ו-linear alpha-blending.
  4. רכישת תמונות ייחוס אימונופלואורסצנטיות של סקירה כללית
    1. רכוש תמונות אימונופלואורסצנטיות משלימות של סקירה כללית באמצעות עדשת אובייקטיב 10x.
    2. דגום את הדגימה כפרוסת z בודדת על ידי שימוש ב-0% חפיפה בין האריחים במהלך רכישת התמונה.
    3. הגדר את כיול התמונה ל-647.249 nm/pixel הן בציר X והן בציר Y, והפק תמונת סקירה המקיפה את כל האזור האנטומי הרלוונטי.
  5. עיבוד תמונות והפקה של איורים סופיים.
    1. ייצא את סטי נתוני התמונות שנרכשו לתוכנה לניתוח תמונות. הפק היטלי עוצמה מקסימלית (MIPs) מסט נתוני ה-z-stack.
    2. בחר אזורי עניין (ROIs) לצורך ניתוח המשך והכנת איורים.
    3. שלב תמונות אימונופלואורסצנטיות של סקירה כללית עם תמונות HE תואמות כדי להפיק איורי ייחוס אנטומיים. לאחר מכן, ודא את היישור וההתאמה האנטומית בין סטי הנתונים הפלואורסצנטיים וההיסטולוגיים לפני הכנת האיורים.
      הערה: כל תפירת התמונות צריכה להתבצע באופן אוטומטי במהלך רכישת התמונות באמצעות הגדרות מיקרוסקופ שנקבעו מראש, ואינה אמורה לדרוש עיבוד נוסף לאחר מכן. במקרה שלנו, הרינדור התלת-ממדי הופק באמצעות תוכנת Imaris: נעשה שימוש בתוסף surface rendering, המבוסס על סף עוצמה (threshold intensity) עבור כל ערוץ שנרכש, כדי להפיק את השחזור התלת-ממדי. לבסוף, התמונות הסופיות נערכו ב-Adobe Illustrator.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישת ה-whole-mount המוצגת כאן אפשרה את הבידוד והשימור של הרירית האולפקטורית במלואה. במקרה שלנו, המיקוד היה בהבנת שינויים תאיים ואנטומיים הן בקנה מידה מאקרוסקופי (מבט אנטומי מלא) והן בקנה מידה מיקרוסקופי (רמה תאית).

גישת ה-whole-mount מאפשרת לנו לאסוף הן את מדורי האפיתליום והן את הלמינה פרופריה (lamina propria), ולשמר את היחסים המרחביים בין צרורות האקסונים, תאי העטיפה הריחיתים (OECs) ופיברובלסטים – התאים המעניינים אותנו. גישה זו אפשרה את רכישתם של מערכי נתונים גדולים ורציפים שתפסו את מלוא העובי ואת שטח הפנים הרחב של רקמת הרירית (איור 3), ואפשרה לנו ללכוד פרטים של המבנה התאי והאינטראקציה המורכבים (איור 3), וכיצד אלו משתנים בין תנאים תקינים (n = 3) (איור 3A, B) לתנאי פגיעה (n = 12) (איור 3C, D).

על ידי שילוב של הליך אופטימי זה לטיפול ברקמה וצביעה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה, הצלחנו להשיג תמונות של אזורי רירית רחבים יותר עם פירוט תאי מדויק וגבוה לכל אורך עומק הרקמה. רכישת Z-stack על פני מספר אזורים סמוכים אפשרה שחזור של תחומים אנטומיים מורחבים מבלי לפגוע ברזולוציה או בשלמות האות (איור 4A–F). הודות לפרטים התאיים ברזולוציה הגבוהה, יכולנו להשתמש ב-Z-stacks שנרכשו עבור מלוא עובי הרקמה (איור 4G) כדי ליצור תמונות מרנדור (איור 4H) להבנה מעמיקה יותר של המיקרו-ארכיטקטורה של הרקמה.

קביעה מהימנה של אוריינטציית הרקמה לפני ההרכבה והדימוי הושגה באופן עקבי ללא צורך בסימון פלואורסצנטי. צד ה-lamina propria היה ניתן לזיהוי בקלות תחת מיקרוסקופיית שדה בהיר (brightfield) הודות לנוכחותם של צרורות עצבים עבים, שהיו מובחנים בבירור משכבת האפיתל. סטנדרטיזציה של אוריינטציית הדגימות, על ידי מיקום ה-lamina propria בסמיכות לכיסוי הזכוכית (coverslip) ופני השטח האפיתליים כנגד למסחת הזכוכית, שיפרה את עקביות הדימוי בין הדגימות והקללה את השחזור התלת-ממדי בשלבים הבאים. ניתן לקבוע את חדירות הנוגדנים על ידי ניתוח האות הנלווה שנצפה לאורך עובי הרקמה. הדבר ניכר בדרך כלל על ידי היעדר אות או על ידי אות הפוחת בהדרגה ככל שמעמיקים אל תוך הרקמה.

רינדור תלת-ממדי שבוצע ב-Imaris אפשר ויזואליזציה ברורה של רשתות תאיים מורכבות וארגון אקסונלי בתוך הרירית השלמה. רינדור מבוסס פני-שטח, שיושם באמצעות סף עוצמה ספציפי לערוץ, יצר ייצוגים תלת-ממדיים מדויקים של ארכיטקטורת הרקמה תוך שימור פרטים מבניים עדינים.

עבור צביעה וויזואליזציה, התוצאות הצפויות כוללות ויזואליזציה ברורה של אות הצביעה של המטרה ללא כל אובדן חריג של האות או הידרדרות של האות לאורך עובי הרקמות. אי-יכולת לבצע ויזואליזציה של מטרה צבועה ידועה במיקרוסקופיה תיחשב כתוצאה לא מוצלחת.

figure-results-1
איור 1. ייצוג של האזור האנטומי עם שכבת כיסוי של רקמת mucosal whole-mount. (A–C). מבט סגיטלי של פנים הנחיר השמאלי (צביעת Hematoxylin and Eosin, HE) של העכבר (A) עם שכבת כיסוי של צביעת mucosa whole-mount מאותו אזור (לצורך אוריינטציה אנטומית) (B) המציגה את הכיוון והמיקום של צרורות אקסונים בירוק עם גרעיני תאים בכחול. טכניקה זו אפשרה את שימור המבנה האנטומי השלם: ניתן להבחין בבירור בעצב הריח הראשוני (ON) ובצרורות אקסונים נלווים (עצבי vomeronasal, VNN) וכן לעקוב אחר נתיבם מהמחיצה לבצול הריח (OB), דרך הלוח המנוקבים (cribriform plate) (B, C). הרקמה המוצגת כאן נצבעה ב-Hoechst עבור הגרעינים (כחול) וב-β-III-Tubulin עבור צרורות האקסונים (ירוק). תמונות מייצגות מתוך n = 15 דגימות עצמאיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-2
איור 2. מבטים מאקרוסקופיים וסכמתיים של מערכת הריח. (A) באמצעות קוצץ עצם, ובהתאם לקו המקווקו באדום, מסירים את עצם המחיצה (האזור הצהוב). (B) לאחר חשיפת חלל הנחיר הקעור שמתחתיה (חום), ניתן לאסוף את כל רקמת הרירית המתרחבת מאזור זה ועד לרירית הנשימה והריח. (C) ייצוג גרפי להמחשת הרצף של מבנים אלו, המשתרעים מהאפיתל הריחני ועד לפחית הריח (olfactory bulb). אנא לחצו כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-3
איור 3. מבט מורחב של האזור האנטומי שהושג באמצעות פרוטוקול איסוף וצביעה של דגימה שלמה (whole-mount). (A–D). מוצגות תמונות מייצגות של ריריות בריאות ופגומות. מלמעלה למטה, רירית שלמה מרקמה בריאה (n = 3) ורירית פגומה (n = 12). ברקמה הבריאה (A), תאי OECs בעלי מורפולוגיה ביפולרית מוארכת (A, שמאל) עוטפים את צרורות האקסונים (A, מרכז), ופיברובלסטים יוצרים את השכבה החיצונית של מבני מנהרה אלו (A, ימין, חץ לבן). שלושת ה-ROIs שנבחרו משקפים פרטים אלו (B). ברירית הפגומה, תאי OECs מציגים מורפולוגיה ביפולרית ועגולה כאחד (C, D, שמאל, חצים לבנים). צרורות האקסונים נראים פחות אחידים וסולידיים (C, D, מרכז, חצים לבנים). פיברובלסטים נראים נפוצים לאורך כל האזור (C, D, ימין, חצים לבנים). סרגל קנה מידה = 100 µm. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-4
איור 4. דימוי פלואורסצנטי תלת-ממדי של דגימות ריצוף של רירית. (A–H). תמונות בהגדלה נמוכה של התאים (A–F) ותמונה בהגדלה גבוהה (G) הושגו ממחסניות תמונות של מספר אזורים עוקבים באמצעות מיקרוסקופ SpinSR. תאי מעטפת ריח (OECs) מוצגים באדום, פיברובלסטים במגנטה, אקסונים בירוק וגרעינים בכחול. חצים מצביעים על מורפולוגיות שונות של OEC (A) ושכבה חיצונית של פיברובלסטים מסביב לאגודות אקסונים (B ו- C). ב-D–F מופיעים חצים המדגישים דמיון במבנים הבריאים של הפיברובלסטים. תמונות אלו הדגישו את הארגון המרחבי של הרכיבים התאיים, אשר לאחר מכן הומאו באמצעות תוכנת Imaris (H). סרגל קנה מידה = 50 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנטמטרהדילולתנאי דגירהרציונל
נוגדן ראשוני
β-III-Tubulin (ארנב)אקסונים1:300במשך 72 שעות ב-4 °C, על גלגלת (roller)לאפשר חדירה בעובי מלא
PDGFR-β (חולדה)פיברובלסטים1:100
נוגדן משני
Alexa 488נוגדנים ראשוניים מארנב1:250עטוף בנייר אלומיניום, למשך 4 שעות לפחות בטמפרטורת החדר על גבי רולר (roller), ולאחר מכן למשך לילה ב-4 °C על גבי רולר.נייר אלומיניום מונע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית); משך הזמן, הטמפרטורה והערבוב באמצעות גלגלת מאפשרים חדירה טובה.
Alexa 647נוגדנים ראשוניים מחולדה1:500
גרעינים
Hoechstגרעיני תא1:2500

טבלה 1: רשימת נוגדנים עם דילולים שעברו אופטימיזציה עבור פרוטוקול זה. טבלה זו מפרטת את ריאגנטים לצביעה, את מטרותיהם, את הדילולים ואת הרציונל לתנאי האינקובציה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשורים האחרונים אנו עדים לתחילתו האיטית של העידן התלת-ממדי, עם פיתוחן של גישות חדשניות רבות בתחום המדעי. לדוגמה, גישות לשחזור תלת-ממדי, שהתאפשרו הודות לפיתוחן של שיטות דימוי מורכבות של דגימות שלמות (whole-mount) בשילוב עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה, סייעו להבנה טובה יותר של מספר מבנים היסטו-ארכיטקטוניים של רקמות בעובי מלא. גישות רינדור תלת-ממדיות אלו שימשו להגדרת מבנים שונים בגוף האדם, כגון כלי דם, בלוטות וגידולים נפוצים4,5,6,7,8,9. יתרה מכך, נאסף מידע על ההבדלים בין מבנים פתולוגיים לנורמליים, למשל, במוחות שלמים של עכברים10,11,12. גישה זו זוהתה כשלב מכריע לקראת הבנה טובה יותר של המערכות הביולוגיות השונות, תוך שהיא מאפשרת הבנה מעמיקה יותר של מעגלים תאיים, הארגון המרחבי המבני והתפקודי שלהם, ותרומתם הפוטנציאלית לפתולוגיות אנושיות.

חיסרון של השילובים השונים של שחזור רקמה תלת-ממדית ודימות הוא שמרבית הגישות כוללות שלבי הבהרה של הרקמה (tissue-clearing). למרות ששיטה זו מועילה עבור רקמות רבות, היא אינה מתאימה לכל סוגי הרקמות8,9,19. למעשה, הליכי ההבהרה כוללים מספר שלבי שטיפה, שעלולים פוטנציאלית לפגוע באפיטופים המותחמים ולהשפיע על אותות אנדוגניים20.

הגישות המתוארות לעיל שימשו להגדרת מבנים תאיים חשובים רבים בתוך מערכות שונות. עם זאת, במערכת הריח ובמבנים הרלוונטיים בה נוכחותם של רכיבים גרמיים שמהם ניתן לבודדם בקלות היא מינימלית; לכן, בשנים האחרונות נבחנו גישות של דגימה שלמה (whole-mount) שאינן כוללות שלבי הבהרה13,14.

מחקרים אלו הכירו בחשיבות של הגדרה טובה יותר של ארגון המבנים העצביים במערכת הריח. בהתאם לכך, מוקד העיקרי היה לספק מפה טופוגרפית ברורה של התפלגות הנוירונים החושיים הריחיים בהתבסס על ביטוי של סמנים שונים14, וכן לחשוף תובנות חדשות לגבי הריסים (cilia) הייחודיים שלהם13.

טכניקת ה-whole-mount שפותחה והוצגה כאן מאפשרת את איסוף ושימור רקמת הרירית בשלמותה, ובכך פותחת אפשרות להשגת תובנות מכריעות לגבי המבנה האנטומי והפיזיולוגי של סביבה זו, עם התמקדות ספציפית, במקרה שלנו, בקשר שבין OECs, פיברובלסטים ואגד של אקסונים. השילוב של טכניקת הבידוד והצביעה המעודנת הזו עם דימיון קונפוקלי ברזולוציה גבוהה אפשר איסוף של תמונות גדולות המשקפות את המבנה של כל אזור המטרה והתאים השוכנים בו. באופן ספציפי, הטכניקה המעודנת שלנו מציעה שני יתרונות מובחנים: כל הרירית נאספת ומעובדת, כולל ארכיטקטורת ה-lamina propria13, ושיטת הכנת הרקמה העדינה יותר מסייעת בשימור האנטומיה במקרו-סקלה וכן אינטראקציות בין-תאיות (כגון תאי olfactory ensheathing, אקסונים ופיברובלסטים) בהשוואה לפרוטוקולי flat-mount אחרים14. זוהי גם הסיבה לכך שפרוטוקול זה אינו כולל תיקוף באמצעות צביעת חתכים דקים.

כפי שצוין לעיל, טכניקות של צביעה שלמה (whole‑mount) כרוכות בדרך כלל בתקופות ארוכות של עיבוד רקמות ובשימוש בריאגנטים ספציפיים ויקרים. שיטה זו פותחה תוך התמקדות בעיבוד מינימלי של הרקמה כדי לצמצם הן את מסגרת הזמן והן את הסיכון לנזק למבנים תאיים חשובים. לפיכך, השיטה האופטימלית מייצגת תהליך מהיר שניתן לבצע באמצעות ריאגנטים הנפוצים באימונוהיסטוכימיה של חתכים דקים, ובכך היא מהווה חלופה תקפה לגישות הדורשות זמני עיבוד ארוכים יותר ואינן מתאימות למבנים ללא עצם, כגון רקמת רירית.

ניתן לבצע את רכישת הדמויות ואת העיבוד שאחריה באמצעות כל פלטפורמה של מיקרוסקופיה קונפוקלית המסוגלת לרכוש z-stacks ברזולוציה גבוהה מדגימות רקמה עבותות, עם חדירת לייזר מספקת כדי לדמות את הריריות הרלוונטיות (עיינו בסעיף השיטות לפרטים נוספים על הגדרות הרכישה ועיבוד הדמויות שלנו).

אנו מאמינים כי באמצעות התאמות מתאימות, ניתן להעתיק וליישם פרוטוקול זה על מודלים נפוצים אחרים של מכרסמים. עם מספר התאמות ספציפיות לרקמה, ניתן ליישם שיטה זו במספר הקשרים שונים, כולל חקר רקמות ריריות ותת-ריריות ממערכת הנשימה וממסכת מערכת העיכול (GIT); חקירת ארגון הרקמות ואינטראקציות רב-מערכתיות בתוך מערכת העצבים; ניתוח תהליכי דלקת ורקמות לימפואידיות הקשורות לריריות (MALTs); וכן בחינה של צירים רב-מערכתיים שונים, כגון ציר המעי-מוח.

החוזק העיקרי של פרוטוקול זה טמון בשיפורים המתודולוגיים המאפשרים דימות תלת-ממדי באיכות גבוהה תוך שמירה על שלמות הרקמה, ובמקביל הבטחת גישה מהירה יחסית בהשוואה למתודולוגיות whole-mount אחרות שנבחנו בעבר בתחום זה.

היישום המוצלח של גישה זו היה תלוי במידה רבה בהבנה אנטומית מעמיקה של הרקמה הרלוונטית. למעשה, במקרה שלנו, הידיעה לגבי המיקום הצפוי של צרורות האקסונים הייתה חיונית כדי למזער את הפולשניות של הליך האיסוף לאחר חשיפת פנים הגולגולת. ידע אנטומי זה היה קריטי ליכולת לאתר במהירות את האזור והרקמה הרלוונטיים ולשמור על המבנה הכללי של הרירית, דבר המדגיש כי עיבוד רקמות מוצלח קשור באופן מהותי לאסטרטגיית איסוף מושכלת ולא רק לשלבי העיבוד שלאחר מכן.

כפי שצוין במספר הערות בסעיף השיטות, התאמות טכניות מרובות היו קריטיות לפיתוח ולאופטימיזציה של שיטה זו. שמירה על הרקמה כשהיא צפה בחופשיות בתוך מבחנות Eppendorf לאורך כל תהליך הצביעה, בשילוב עם סיבוב רציף במהלך הדגרת הרכיבים והנוגדנים, היוו שלב מפתח בהשוואה לפרוטוקולים סטטיים יותר של צביעת רקמה שלמה (whole-mount) או של חתכים דקים. שיפור זה מנע קיפול של הרקמה ובו בזמן הבטיח חדירה הומוגנית של הרכיבים לכל הדגימה, ובכך שיפר את עקביות הצביעה ללא צורך בשלבי הבהרה מיותרים. בנוסף, אופטימיזציה קפדנית של משך ההדגרה עבור כל רכיב ותערובת נוגדנים התגלתה כחיונית. שלב אחרון זה עשוי לדרוש התאמה נוספת בהתאם לסוג הנוגדן שנבחר.

יחד, גורמים ספציפיים אלו הובילו לשיפור השחזוריות תוך הפחתת זמן העיבוד הכולל וצמצום הטיפול הגס בדגימות.

שלב מתודולוגי חשוב נוסף היה היכולת לקבוע באופן מהימן את כיוון הרקמה לפני הקיבוע והדימוי, ללא צורך בסימון פלואורסצנטי. ניתן היה לזהות בקלות את צד ה-lamina propria של רקמת הרירית תחת מיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield microscopy) על ידי נוכחותם של צרורות עצבים עבות, הניתנות להבחנה בבירור מהרקמה האפיתליאלית שמסביבן. נמצא כי סטנדרטיזציה של כיוון הדגימה, על ידי מיקום ה-lamina propria הפונה לצד הזכוכית המכסה (coverslip) והשכבה האפיתליאלית הנחה על גבי הפלייד, משפרת את איכות רכישת הדימויים. יישוב פשוט אך יעיל זה שיפר את עקביות הדימוי בין הדגימות ותרם לאיכות השחזורים התלת-ממדיים שהתקבלו.

עם זאת, ישנן מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון. פרוטוקול זה לא נבדק על זני עכברים נפוצים רבים או על מיני מכרסמים אחרים. באופן דומה, האופטימיזציות בוצעו תחת התנאים הניסיוניים הספציפיים שתוארו לעיל ורק עם פאנלי הנוגדנים המפורטים. למרות שהפרוטוקול אמור לעבוד עם רוב זני העכברים והחולדות, עם מספר נוגדנים שונים ועם כל המודלים הניסיוניים המאפשרים קצירה של ריריות בעובי מלא, ייתכן ויהיה צורך באופטימיזציה מדויקת נוספת. מגבלה בולטת נוספת היא שניתן לצבוע חתך whole-mount בודד עם פאנל נוגדנים אחד בלבד, בניגוד לרקמות שנתחתו לחתכים דקים, שבהם כל חתך יכול לצבוע בפאנל נוגדנים בודד ולכן ניתן לבחון מספר פאנלים שונים של נוגדנים ברקמות בחתכים דקים.

באופן כללי, חידושים מתודולוגיים אלו מדגימים כיצד התאמות פשוטות יחסית לטיפול ברקמות, לתנאי הצביעה ולכיוון הדגימה יכולות לשפר באופן משמעותי את תוצאות הדימות בשיטת whole‑mount. על ידי הימנעות משלבים נרחבים של עיבוד והבהרה של הרקמה, גישה זו מציעה חלופה מעשית וגמישה לחקר רקמות עדינות וחסרות עצם, תוך שהיא מאפשרת עדיין רכישה של נתונים תלת-ממדיים מפורטים ובקנה מידה גדול.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודים עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במימון מקרן Clem Jones, מקרן Perry Cross Spinal Research ומקומיסיית ביטוח תאונות דרכים (Motor Accident Insurance Commission) עבור JSTJ ו-RR, במלגת National Injury Insurance Scheme Queensland עבור RR, ובמלגת קרן Perry Cross Spinal Research עבור FO. חלק מפרויקט זה נתמך על ידי "מלגת מחקר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת גריפית' (GUPRS)" ו"מלגת מחקר בינלאומית לתארים מתקדמים של אוניברסיטת גריפית' (GUIPRS)" עבור FO.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294-50Gאימונוהיסטוכימיה
Adobe Illustratorversion 28.5
נוגדן Anti-beta III Tubulin - סמן נוירונליAbcamab18207
נוגדן Anti-PDGFR beta [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochlorideSigma Aldrich14533
COVERSLIP 24X50MM NO. 1.5 100PCSBio-strategyEPBRCS245015GPאימונוהיסטוכימיה
נוגדן משני Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Highly Cross-Adsorbed, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
קוצץ עצם Dumont #15A - מצופה אפוקסיDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02דיסקציה של רקמה
פינצטה Dumont #7 - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10דיסקציה של רקמה
נוגדן משני Goat anti-Rat IgG (H+L), Cross-Adsorbed, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
תוכנת ImarisImarisversion 9.5.0דימיון
מספרי דיסקציה מסוג MayoProSciTech420SSדיסקציה של רקמה
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gעיבוד רקמות
מלחים של פוספט בבופר סלין, טבליות PBS סטריליות (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014עיבוד רקמות
ProLong Glass Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36980אימונוהיסטוכימיה
להב סקלפל #23Scalpel Blades Swann MortonCOS240Bדיסקציה של רקמה
ידית סקלפל #4ProSciTechT134דיסקציה של רקמה
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-25Gעיבוד רקמות
SucroseChem-Supply57-50-1עיבוד רקמות
שקופיות מיקרוסקופ TOMO AdhesionProSciTechGEMS63705-09אימונוהיסטוכימיה
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLאימונוהיסטוכימיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li Y, Field P M, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997;277 (5334),2000–2002.
  2. Li Y, Field P M, Raisman G. Olfactory ensheathing cells and olfactory nerve fibroblasts maintain continuous open channels for regrowth of olfactory nerve fibres. Glia. 2005;52(3):245–251.
  3. Yamaguchi M, et al. The New Era of Three-Dimensional Histoarchitecture of the Human Endometrium. J Pers Med. 2021;11(8).
  4. Falk M, Ynnerman A, Treanor D, Lundström C. Interactive visualization of 3D histopathology in native resolution. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 2018;25(1):1008–1017.
  5. Kiemen A, et al. In situ characterization of the 3D microanatomy of the pancreas and pancreatic cancer at single-cell resolution. BioRxiv. 2020.2012. 2008.416909, (2020).
  6. Tian J, et al. Three-dimensional reconstruction of laryngeal cancer with whole organ serial immunohistochemical sections. Sci Rep. 2020;10(1):18962.
  7. Lotz JM, et al. Integration of 3D multimodal imaging data of a head and neck cancer and advanced feature recognition. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2017;1865(7):946–956.
  8. Nojima S, et al. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Sci Rep. 2017;7(1):9269.
  9. Tainaka K, et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell reports. 2018;24(8):2196–2210.e2199.
  10. Onozato ML, Klepeis VE, Yagi Y, Mino-Kenudson M. A role of three-dimensional (3D)-reconstruction in the classification of lung adenocarcinoma. Stud Health Technol Inform. 2012;35(2):79–84.
  11. Hama H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of the transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011;14(11):1481–1488.
  12. Tainaka K, et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014;159(4):911–924.
  13. Oberland S, Neuhaus EM. Whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice. J Vis Exp. 2014;10.3791/52299(94).
  14. Gavid M, et al. Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons. PLoS One. 2023;18(1):e0280497.
  15. Windus LC, et al. Stimulation of olfactory ensheathing cell motility enhances olfactory axon growth. Cell Mol Life Sci. 2011;68(19):3233–3247.
  16. Windus LC, Claxton C, Allen CL, Key B, St John JA. Motile membrane protrusions regulate cell-cell adhesion and migration of olfactory ensheathing glia. Glia. 2007;55(16):1708–1719.
  17. Windus LC, et al. Lamellipodia mediate the heterogeneity of central olfactory ensheathing cell interactions. Cell Mol Life Sci. 2010;67(10):1735–1750.
  18. Chehrehasa F, et al. Olfactory glia enhance neonatal axon regeneration. Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):277–288.
  19. Ueda HR, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020;21(2):61–79.
  20. Jing D, et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res. 2018;28(8):803–818.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים