מחקר מודל עכברוש חקרני זה מציג מיקרו-מחט פעילה עם פיזור רמן משופר על פני שטח (SERS) לצורך התערבות סימולטנית בדיקור ומעקב רטורי של מדדי SERS הקשורים ליכולת חמצונית מקומית ופוטנציאל רדוקס בעכברים עם פגיעה בסבילות לגלוקוז.
מאמר מחקר
מחקר מודל עכברוש חקרני זה מציג מיקרו-מחט פעילה עם פיזור רמן משופר על פני שטח (SERS) לצורך התערבות סימולטנית בדיקור ומעקב רטורי של מדדי SERS הקשורים ליכולת חמצונית מקומית ופוטנציאל רדוקס בעכברים עם פגיעה בסבילות לגלוקוז.
פגיעה בסבילות לגלוקוז (IGT) קשורה להפרעה בהומאוסטזיס רדוקס ולעלייה בלחץ חמצוני, אך מעקב דינמי בחיים אחר שינויים הקשורים לרדוקס במהלך התערבות דיקור סיני נותר מאתגר מבחינה טכנית. מחקר זה פיתח מערכת מיקרו-מחט פעילה עם פיזור רמאן (SERS) הרגישה ל-Redox, לצורך התערבות סימולטנית בדיקור סיני ומעקב יחסי של מדדי SERS הקשורים לפוטנציאל החמצון (OC) ו-RP (RP) בחולדות עם IGT. גשושי SERS רגישים לחמצון ורדוקס הוכנו על ידי פונקציונליזציה של ננו-קליפות זהב (GNS) עם p-פנילנדיאמין (p-PDA) לתגובה ל-OC ואנתראקינון לתגובה ל-RP, בהתאמה. הגשושים הועמסו לשני חריצים חרוטים על מחטי דיקור לבניית מיקרו-מחטים הפעילים ב-SERS. במחקר חקר זה נעשה שימוש בזכרים זכרים ללא פתוגנים ספציפיים מסוג Sprague–Dawley. שלוש חולדות שימשו כביקורת נורמלית, ו-20 חולדות קיבלו תזונה עתירה בשומן וקיבלו סטרפטוזוטוצין (STZ) לגרימת IGT. לאחר הסקר, 18 חולדות זכאיות ל-IGT חולקו לקבוצות דיאטה עתירה שומן ודיאטה נורמלית, כאשר 9 חולדות בכל קבוצת דיאטה. כל קבוצת דיאטה חולקה עוד יותר לסיבוב נקודות דיקור, סיבוב אתר ללא דיקור, ותת-קבוצות של סיבוב מיקום ישיר בנקודת דיקור, עם 3 חולדות בכל תת-קבוצה. הדקירה בוצעה פעמיים ביום במשך 7 ימים רצופים, ונרשמו רמות סוכר בצום (FPG), 2 שעות גלוקוז לאחר הארוחה (2hPG), ומדדי SERS הקשורים ל-OC ו-RP. התוצאות הראו כי דקירה בנקודות דיקור סיני עם סיבוב הייתה קשורה לערכי FPG ו-2hPG נמוכים יותר ולשינויים במדדי SERS הקשורים ל-OC ו-RP במודל IGT זה. מכיוון שעקומות כיול חיצוניות, מבחני מתח חמצוני ביוכימיים עצמאיים, בדיקות חליפת חמצון ובדיקות תאימות ביולוגית לא נכללו, יש לפרש את יחסי SERS כאינדקסים אופטיים יחסיים הקשורים לחמצון אדום ולא כריכוזים ביוכימיים מוחלטים או ערכי פוטנציאל רדוקס מוחלט. ממצאים אלו תומכים בהיתכנות של מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS כפלטפורמה חקרנית פרה-קלינית לשילוב התערבות דיקור עם מעקב SERS לפי יחס מקומי בעכברי IGT.
פגיעה בסבילות לגלוקוז (IGT), ירידה ביכולת הגוף לסבול גלוקוז, מייצגת שלב מעבר בין רמת סוכר תקינה בדם לסוכרת1. לכן, IGT הוא אות אזהרה מוקדמת מרכזי ושלב הפיך בהתפתחות סוכרת סוג2 2. נתונים קליניים מראים שכ-30% מהאוכלוסייה עם IGT יתקדמו לסוכרת סוג 2 בתוך 5–10 שנים3; עם זאת, עם התערבות מהירה, ניתן להוריד אחוז זה לפחות מ-10%4.
IGT הוא תהליך דינמי ומורכב, וסביבה מתמשכת עם רמות גלוקוז גבוהות היא טריגר מרכזי להפרעות מטבוליזם חמצוני. כאשר הגוף נמצא במצב ממושך של היפרגליקמיה, שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית פועלת באופן לא תקין, וקצב ייצור מיני החמצן הפעיל עולה ב-30–50%, מה שמגביר ישירות את כוח החמצון בגוף6; במקביל, רמות סוכר גבוהות מעכבות את פעילות האנזימים המרכזיים, כגון גלוטתיון רדוקטאז, ומונעות ממערכת נוגדי החמצון להסיר מינים עודפים של חמצן פעיל בזמן ומפריעות עוד יותר לאיזון בין חמצון להפחתת. בנוסף, IGT מלווה בשינויים פתולוגיים, כולל עמידות לאינסולין ופגיעה קלה בתפקוד תאי β, מה שמוביל למגוון תגובות ביולוגיות וביוכימיות 7,8. יחד עם התפתחות מצב החמצון האדום, שינויים אלה מחמירים עוד יותר את ההפרעה במטבוליזם של הגלוקוז ומגבירים את הסיכון הפוטנציאלי לסיבוכי סוכרת, כולל רטינופתיה, נפרופתיהומחלות לב וכלי דם. לכן, ניטור קיבולת חמצונית (OC) ופוטנציאל חימצון רדוקסיטיבי (RP) אצל יחידים או מודלים של בעלי חיים עם IGT צריך לשפר את הבנתנו את המנגנונים שמאחורי התפתחות IGT ולהנחות את עיצוב אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות.
לדיקור סיני היסטוריה של יותר מ-3,000 שנה והראה יעילות קלינית טובה בטיפול במחלות רבות11. יתרה מזאת, מחקרים ניסיוניים רבים בבעלי חיים הראו כי דיקור סיני מפעיל השפעות חיוביות בוויסות מצבי לחץ חמצוני במודלים של בעלי חיים, על ידי חיזוק מערכת האנזימים נוגדי החמצון והפחתת פרוקסידציה של שומנים12. כפרקטיקה רפואית סינית מסורתית, דיקור סיני הראה גם יתרונות משמעותיים בטיפול בסוכרת וב-IGT. נקודות דיקור גואניואן (CV4) וסאנינג'יאו (SP6) דווחו כמפעילות את מסלול SIRT1/PGC-1α בשריר השלד, ובכך מקלות את עמידות האינסולין של עכברים סוכרתיים להשמנה13. יתרה מזאת, נקודות דיקור טיאנשו (ST25) מווסתות את פעילות הנוירונים המעכבים את הגלוקוז הממוקמים באזור ההיפותלמוס הלטרלי ותורמות לויסות חילוף החומרים של הגליקוליפידים14. עם זאת, רוב המחקרים על מנגנוני הדיקור התוך-כלי התמקדו בעיקר במערכות הנוירומודולטוריות, האימונומודולטוריות ומערכת העיכול, שבהן דיקור עשוי להשפיע על מטבוליזם הגלוקוז באמצעות ויסות תפקוד אוטונומי או לווסת בעקיפין את רמות הגלוקוז בדם על ידי שיפור איזון הפלורה המעיים15,16. המנגנון הספציפי של השפעת הדיקור בטיפול ב-IGT והשפעותיו על לחץ חמצוני חסר מחקר מעמיק ותמיכה בנתונים ניסיוניים.
פיזור רמאן משופר על פני השטח (SERS) מספק רגישות וספציפיות גבוהות, המאפשרים זיהוי מגוון רחב של אנליטים. ננו-פרובי SERS המבוססים על ננו-סיבים אופטיים17, ממברנות כיטוזן18, ומחקרים קודמים הראו כי מחטי דיקור19 יכולות לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים, נוירוטרנסמיטרים והיבטים נוספים של ביוכימיה תאית ב-vivo. מחטי דיקור, במיוחד, מהוות כלים מבטיחים לבדיקות רקמות עמוקות, המאפשרים ניטור מינימלי פולשני במקום ואחריו ניתוח אקס ויבו. דיקור, כשיטה טיפולית מבוססת, יש לה מגוון רחב מאוד של יישומים קליניים. מחקרים עדכניים הראו שסיבים אופטיים מופעלים על ידי SERS, תחבושות פצעים ומכשירי מיקרו-מחט יכולים לתמוך במעקב במקום או באופן מינימלי פולשני של אותות הקשורים לחמצון אדום בסביבות ביולוגיות רלוונטיות20,21. במקביל, מחטי דיקור אקטיביות ב-SERS ומערכות מיקרו-מחט קשורות הפכו לנושאים מבטיחים לשילוב יכולת החישה עם התערבות רקמה19, מה שמוביל למיקרו-מחטים פעילות ב-SERS עם יכולת זיהוי SERS ב-in vivo ובתנאי SERS במבחנה.
המחקר הנוכחי מתבסס על אסטרטגיית מחטים מיקרו-פעילה ב-SERS שדווחה בעבר לזיהוי אותות הקשורים לפוטנציאל חמצון ופוטנציאל חמצון במודלים של לחץ מונע גלוקוז. עם זאת, העבודה הנוכחית שונה מהמחקר הקודם הן בהקשר הביולוגי והן במטרת הניסוי. באופן ספציפי, מחקר זה מיישם את פלטפורמת המחט המיקרו-פעילה של SERS על מודל חולדה של פגיעה בסבילות הגלוקוז ומשלב מעקב מקומי של SERS עם התערבות בדיקור סיני. המחקר הנוכחי משווה עוד נקודות דיקור לאתרים סמוכים שאינם דיקור, מעריך מניפולציות שונות של דקירות, ומנטר את מדדי SERS הקשורים לחמצון אדום במהלך תקופת התערבות בת 7 ימים. בהשוואה לסיבים אופטיים מבוססי SERS, תחבושות פצעים ומחטים מיקרו-פעילות ב-SERS שתוכננו בעיקר לזיהוי ביוכימי חד-אתר או יחיד, הפלטפורמה הנוכחית מספקת שתי התקדמות. ראשית, גשושים מגיבים ל-OC ו-RP משולבים בשני חריצים חרוטים עצמאיים על מחט דיקור אחת, המאפשרים ניטור בו-זמני של פרמטרי רדוקס משלימים במקביל. שנית, מחט הדיקור משמשת לא רק כנושאת גלאי SERS אלא גם כמכשיר טיפולי, המאפשר לבצע ניטור רדוקס במהלך התערבות בדיקור ולא לאחר הטיפול. כפי שמוצג באיור 1, לאחר שהמיקרו-מחטים הוכנסו לרקמות, נוצרים פצעים זעירים, והגלאים בשני החריצים מגיבים עם רקמות, מה שמאפשר להן לזהות רמות של OC ו-RP ב-vivo. מטרת המחקר הייתה להשתמש במחטים המיקרו-פעילות ב-SERS כדי לבחון שינויים ב-OC וב-RP בעכברים עם IGT ולקבוע את השפעות הדיקור התואם לנקודות דיקור בבעלי חיים אלו, ובכך להשיג תובנות חשובות לגבי מנגנון השפעות הדיקור בטיפול ב-IGT והקשר בין רדוקס למצבים היפרגליקמיים חריגים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בעלי חיים ודגמים של IGT
כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון למחקר סוז'ואו של אוניברסיטת דרום-מזרח (אישור מס' SEU-IACUC-20250318007) ובוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. העכברים נאספו והוחזקו בתנאי SPF (SPF) בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך. בהליכים שדרשו הרדמה, חולדות הורדמו באמצעות איזופלוראן שסופק בחמצן דרך תא השראה ונשמרו באמצעות קונוס אף. איזופלוראן שימש ב-3% לאינדוקציה ו-1% לתחזוקה, כאשר הריכוז הותאם בהתאם לקצב הנשימה ולתגובה הפרוצדורלית.
עומק ההרדמה המתאים אושר לפני דקירה או הזרקה בשל אובדן הרפלקס המתיישר והיעדר תגובה לצביטת האצבעות. במהלך ההרדמה, נבדקו דפוסי הנשימה, מיקום הגוף וההתאוששות, והחיות הונחו על כרית חימום לשמירת טמפרטורת הגוף. בעלי חיים היו מאוחסנים ב-2 בכל כלוב עם גישה חופשית למזון ולמים, אלא אם כן נדרשה צום לבדיקת סוכר. לאחר ההגעה, העכברים הסתגלו למשך שבוע לפני הכנסת המודלים. רווחת בעלי החיים נבדקה מדי יום, כולל פעילות כללית, טיפוח, צריכת מזון, משקל גוף, מצב אתר ההזרקה וההחלמה לאחר הרדמה. בסיום המחקר, חולדות הושמתו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר. המתת חסד בוצעה באמצעות שאיפת CO₂ במילוי הדרגתי, ולאחר מכן אישור המוות באמצעות שיטת ניתוק צוואר הרחם. בעלי חיים שעמדו בקריטריונים של נקודת סיום אנושית, כולל ירידה חמורת במשקל, חוסר תנועה מתמשך, נשימה לא תקינה, חוסר יכולת לאכול או לשתות או מצוקה חמורה, הושמתו מיד במקום להישמר עד לנקודת הסיום המתוכננת. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי ספרג–דולי זכרים בדרגת חסרי פתוגנים ספציפיים במשקל 200 ± 20 גרם. לאחר שבוע של הסתגלות, חולקו החולדות באקראי לשתי קבוצות: שלושת העכברים בקבוצה הרגילה קיבלו אוכל רגיל, בעוד ש-20 החולדות בקבוצת המודל קיבלו אוכל עשיר בשומן (50% צ'או בסיסי + 10% שומן + 25% סוכרוז + 15% אבקת חלמון) במשך 3 שבועות. בעלי החיים בקבוצת המודל קיבלו הזרקה תוך-חוצפית של 20 מ"ג/ק"ג של תמיסת STZ של 2% (ממוססת ב-0.1 מול/ליטר, pH 4.4 בופר ציטראט) למשך 12 שעות, לאחר 12 שעות צום ללא הגבלת מים. אלו בקבוצה התקינה קיבלו הזרקה תוך-פריטוניאלית של המינון המתאים של תמיסת בופר ציטראט לאחר שקיבלו אוכל תקין. בדיקת סבילות לגלוקוז תוך-פריטוניאלי (IPGTT) בוצעה שבוע לאחר מכן. חומרים וציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.
רמת סוכר בצום (FPG) נמדדה על ידי איסוף דם מקצה הזנב של חולדות בכל קבוצה לאחר 12 שעות צום ללא הגבלת מים, ו-2 שעות גלוקוז בדם לאחר הארוחה (2hPG) נרשמו לאחר הזרקה תוך-פריטונלית של 20% דקסטרוז 2 גרם לק"ג. בקבוצה התקינה, טווח ה-FPG היה 5.1–6.6 mmol/L, וטווח גלוקוז של 2hPG היה 7.3–9.4 mmol/L, לעומת FPG של ≤7.0 mmol/L וטווח של 2hPG של 10–16 mmol/L בקבוצת המודל. מבין 20 העכברים שהוקצו לאינדוקציה במודל IGT, 18 עמדו בקריטריוני IGT שהוגדרו מראש לאחר IPGTT ונכללו בניסוי ההתערבות הבא. שני חולדות הוצאו משום שערכי FPG או 2hPG שלהם היו מחוץ לטווח IGT שהוגדר מראש. 18 העכברים הזכאים חולקו באקראי לקבוצת תזונה עתירת שומן וקבוצת תזונה נורמלית, עם 9 חולדות בכל קבוצה. כל קבוצת דיאטה חולקה עוד לשלוש תת-קבוצות: סיבוב נקודות דיקור, סיבוב אתר ללא דיקור, והחדרה ישירה בנקודת דיקור, עם שלושה חולדות בכל תת-קבוצה. זהו מחקר פיתוח שיטה חקרני שנועד להעריך את היתכנות השילוב של התערבות דיקור עם מעקב רטורי מבוסס SERS במודל עכברוש IGT פרה-קליני. לא בוצע חישוב סטטיסטי פורמלי של עוצמה. גודל תת-הקבוצה של שלושה חולדות נבחר על בסיס היתכנות, מחקרים ראשוניים של SERS-מיקרו-מחטים, ועקרון הפחתת בעלי חיים. החולדות חולקו באקראי על ידי הניסוי; לא בוצעו הסתרה פורמלית של הקצאה ועיוורון.
פרוטוקולי הטיפול בדיקור סיני נבדקו בהתייחס להנחיות פרקטיקה קלינית מבוססת ראיות לרפואה הסינית המסורתית, ולהיתכנות ניסויים בבעלי חיים22. נקודות הדיקור שנבחרו היו ג'ונגוואן (RN12/CV12), שואייפן (RN9/CV9), יינג'יאו (RN7/CV7), טיאנשו הדו-צדדי (ST25), שואידאו דו-צדדי (ST28), ודו-צדדי זוסאנלי (ST36). RN12, RN9 ו-RN7 היו ממוקמים בקו האמצע הקדמי וטופלו כנקודות אמצע יחידות, בעוד ש-ST25, ST28 ו-ST36 טופלו דו-צדדית. זיווגי נקודות הדיקור התבססו על אלו ששימשו לטיפול קליני ב-IGT23. ההתאמה התבססה על הספרות24,25, תוך שימוש בשיטה הדיכוטומית. בעכברים, נקודות דיקור היו ממוקמות לפי נקודות ציון אנטומיות והמרה פרופורציונלית ממיקומי נקודות דיקור אנושיות סטנדרטיות. נקודות ה-RN/CV בבטן זוהו לאורך הקו האמצעי הקדמי באמצעות תהליך הזיפואיד, הטבור וסימפיזית הערווה כסימני דרך אנטומיים. ST25 סומן דו-צדדית ברמת הטבור, ו-ST28 סומן דו-צדדית באזור הבטן התחתונה באותו מרחק צידי מהקו האמצעי הקדמי. ST36 זוהה בגפה האחורית הקדמית באזור הקדמי של הטיביאליס, לטרלי לפקעת השוקה. אתרי השוואה סמוכים ללא דיקור סיני סומנו במרחק של 5 מ"מ לרוחב לנקודות האקווריום המתאימות ומחוץ לקו המרידיאן המוכר, תוך הימנעות מכלי דם נראים לעין, צלקות ואתרי ניקוב קודמים. לפני הדקירה, חולדות הורדמו באיזופלוראן בהתאם לפרוטוקול החי המאושר והונחו על השכיבה על כרית חימום. עור הבטן והגפה האחורית מעל כל אתר יעד גולח וחוטא ב-75% אתנול. מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו בערך בניצב לעור לעומק של כ-10 מ"מ. בקבוצות סיבוב נקודות הדיקור, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות האקוורט שנבחרו וסובבו בעדינות דו-כיווני במהלך תקופת החזקה של 20 דקות. עבור קבוצות שאינן אתרי דיקור, אותו הליך בוצע באתרי השוואה ללא דיקור באורך 5 מ"מ סמוכים. בקבוצות ההחדרה הישירה, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות הדיסיון והוחזקו למשך 20 דקות ללא סיבוב. כל הליכי הדירה בוצעו על ידי אותו מפעיל מיומן כדי למזער את השונות בין המפעילים.
הדקירה בוצעה פעמיים ביום, ב-10:00 וב-15:00, במשך 7 ימים רצופים. לפני כל הליך, נמדד FPG לאחר 8 שעות צום ללא הגבלת מים. לאחר כל הליך הדקירה, נרשמו תגובות OC ו-RP. ביום השביעי, לאחר טיפול בדיקור, בוצע IPGTT ונרשמו ערכי 2hPG.
אזהרות
סטרפטוזוטוצין מסוכן ויש לטפל בו כחומר כימי רעיל. הכינו את תמיסת הסטרפטוזוטוצין במכסה אדים כימי או בארון בטיחות ביולוגית מוסמך, תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל, משקפי מגן ומסכה. יש לטפל במזרקים, מחטים, מגבונים, מצעים, כלובים ופסולת הקשורה לבעלי חיים בהתאם לנהלים מוסדיים לטיפול בפסולת ביולוגית וכימית מסוכנת. יש להשליך מיד מחטים ומזרקים משומשים למיכלי חדים עמידים לדקירה, ללא כיסוי מחדש.
ייצור מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לזיהוי OC ו-RP
מחטי דיקור סיני הוכנו כפי שדווח קודםלכן 26. מחטי מיקרו-פעילות ב-SERS יוצרו באמצעות אותו סוג של מחטי דיקור נירוסטה מסחריות (0.25 מ"מ × 26 מ"מ) לאורך כל המחקר. המחטים הוכנסו בערך בניצב לעור לעומק של 10 מ"מ. בקבוצות סיבוב, סיבוב ידני דו-כיווני בוצע בעדינות ובעקביות במשך 20 דקות במהלך תקופת ההחזקה על ידי אותו מפעיל מיומן. המניפולציה לא נשלטה על ידי מכשירים; לכן, תדירות הסיבוב המדויקת והמשרעת לא נמדדו. מגבלה זו הוכרה בדיון.
בהתחלה, המחטים הושרו בתמיסת PMMA של 20% (ללא ז) ב-MMA, ולאחר מכן ייבשו בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך יום אחד. לאחר מכן, נוצרו שתי שקעים מקבילים בגודל אחיד ובעלי צורה ועומק דומים בשכבת ההגנה של PMMA (במרחק 5 מ"מ) באמצעות להב סכין מלאכה קטן שנוקה; לאחר מכן, המחטים טבלו בחומצה גופרתית בעומק 0.5 מטר, ששימשה כאלקטרוליט במשך 10 שניות לעבור חריטה אלקטרוכימית במתח של 12 וולט, וכך נוצרו שני חריצים כמעט מעגליים באתרי הניקוד. שלישית, לאחר שטיפה בשלוש הזדמנויות, המחטים טבלו בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות בתמיסת אתנול המכילה 0.1 mol L−1 MPTES ו-0.3 mol L−1 APTES, ובכך העניקה פונקציונליות סולפידריל למשטחים החריציים. רביעית, הציפוי הוסר על ידי טבילת המחט לתוך MMA. מחטים מיקרו-פעילות עם פוטנציאל רדוקס עם SERS הוכנו על בסיס שיטה שדווחה קודםלכן 27. מצע ה-SERS נספג על אחד החריצים החרוטים של כל מחט דיקור, ולאחר מכן הוטבלו המיקרו-מחטים הפעילים ב-SERS בתמיסת p-PDA מימית בריכוז של 1 ×-10-4 מול/ליטר למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מה שהוביל למחטים מיקרו-פעילות עם חמצון. סובסטרטים של SERS המבוססים על ננו-קליפות זהב סונתזו כפי שתוארקודם 28. בעבודה הנוכחית, מחטים אלו נטפטו אל החריץ השני של כל מחט דיקור, ואז נותרו להתייבש באופן טבעי. זה הניב מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS עם תגובת OC ו-RP.
הערכה מחוץ לחיים של OC ותגובת RP למחטים מיקרו-פעילות ב-SERS
תגובות ה-OC וה-RP הוערכו על ידי החדרת מחטי המיקרו-פעילות ב-SERS לרקמת ex vivo . כדי לבדוק את תגובתות הגשוש החיצוני לשינויים חמצניים, נרשמו ספקטרום SERS של p-PDA לפני ואחרי החמצון. ספקטרום של גשושי SERS רדוקס נרכשו גם בתמיסתNaBH 4 עם הפחתת חזקה ותמיסת HAuCl4 מחמצנת בעוצמה. הסלקטיביות של גלאי ה-OC הוערכה באמצעות סוכנים מפזרים, כולל 1 × 10-4 M FeSO4, 1 × 10-4 M Na2SO4, ו-1 × 10-4 M חומצה אסקורבית, וכן סוכנים מחמצנים, כולל 1 × 10-4 M CuSO4, 1 × 10-4 M H2O2, 1 × 10-4 M FeCl3, ו-1 × 10-4 M HAuCl4. כל התמיסות הוכנו ב-20 mM PBS (pH 7.4), והגלאים הוגדרו עם כל תמיסה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עמידות המחטים המיקרו-פעילות ב-SERS הוערכה על ידי רישום תגובות OC לפני ואחרי תגובה עם 1 × 10-4 mol/L FeCl3 בטמפרטורת החדר. בדיקות אקס ויבו ובדיקות מבוססות פתרון שימשו לאישור תגובתיות הגשוש בתנאים מבוקרים. עם זאת, הם אינם משחזרים במלואם את המורכבות של מיקרו-סביבת הרקמות ב-in vivo , שבה שונות מקומית ב-pH, ספיגת חלבונים, רכיבי מטריצה חוץ-תאית וחומרים ביולוגיים אחרים עשויים להשפיע על אותות SERS. לכן, קריאות ה-OC וה-RP ב-in vivo פורשו כמדדי SERS יחסיים הקשורים לחמצון אדום ולא כמדידות ביוכימיות בלתי תלויי מטריצה.
זיהוי OC ו-RP באתרים של דיקור סיני וללא דיקור
כדי להעריך את ביצועי ה-OC וה-RP בנקודות דיקור סיני ונקודות שאינן דיקור, הוכנסו מחטי המיקרו-פעילות ל-SERS לחולדות בריאות בנקודות הדיקור ST36 ו-RN12, ובעומק של כ-10 מ"מ לאורך זמן זה.
השפעות סיבוב המחטים על זיהוי OC ו-RP
כדי להעריך את התגובה של גשושי ה-OC וה-RP בטכניקות דקירה שונות, הוכנסו מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לנקודות הדיקור ST36 ו-RN12 ו-5 מ"מ סמוכות לנקודות אלו בחולדות בריאות לעומק של כ-10 מ"מ. בכל נקודת דיקור, מחט אחת סובבה, בעוד שהמחט הסמוכה לנקודה לא סובבה, ולהפך (מחט סמוכה לנקודת דיקור סיני סובבה, בעוד שהמחט המקבילה בנקודת הדיקור לא סובבה). אותות SERS מהגשושים נאספו באותו זמן החדרה לכל מחט.
שינויים ב-OC וב-RP אצל חולדות עם IGT ביחס לנקודות דיקור, סיבוב מחטים ותנאי תזונה
כדי להעריך את השפעות נקודות הדיקור, סיבוב המחטים ותנאי התזונה על OC ו-RP של חולדות עם IGT, חולדות בקבוצת הדיאטה עתירת השומן חולקו באקראי לשלוש קבוצות (A1, A2 ו-A3; שלושה חולדות בכל קבוצה), כמו גם אלו שבקבוצת התזונה התקינה (קבוצות B1, B2 ו-B3; שלוש חולדות בכל קבוצה). לחולדות בקבוצות A1 ו-B1, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות דיקור לאחר ההרדמה וסובבו במשך 20 דקות; אותו הליך בוצע עבור חולדות בקבוצות A2 ו-B2, פרט לכך שהמחטים המיקרו-הוכנסו 5 מ"מ סמוך לנקודות הדיקור. בעכברים ב-A3 ו-B3, המחטים המיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות דיקור בעכברים ללא סיבוב; המחטים נשארו במקום למשך 20 דקות. הדקירה בוצעה פעמיים ביום, בשעה 10:00 ו-15:00, במשך 7 ימים. לפני כל פרוצדורה יומית, מד סוכר שימש לרישום ערכי FPG לכל קבוצת חולדות (לאחר צום אך ללא הגבלת מים למשך 8 שעות). לאחר כל יום של דקירות, תגובות OC ו-RP נמדדו ונרשמו. ביום השביעי, לאחר הדיקור, בוצע IPGTT על כל קבוצת חולדות, ונרשמו ערכי 2hPG.
אפיון ומדידה
המורפולוגיה של מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM). ספקטרום SERS נרכש בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, באמצעות ספקטרומטר רמאן שהוגדר עם מטרה לטווח עבודה ארוך של 50× (NA: 0.5) ולייזר בקוטר 785 ננומטר. לכל המדידות, זמן הרכישה היה 10 שניות, ומערכת רמאן הופעלה בהגדרת הספק לייזר נומינלית של 600 מיקרווואט באותה תצורה אופטית. עוצמת הלייזר בפועל שהועברה על פני הרקמה לא נמדדה ישירות במחקר זה. לכן, ספקטרום ה-SERS שימש להשוואות יחסיות בין קבוצות תחת הגדרות רכישה זהות, ולא הוסקו מסקנות לגבי בטיחות פוטותרמית מוחלטת של הרקמות. יחסי העוצמה של שני גשושי SERS חושבו בגישה הבאה: יחס העוצמה ב-1450 ס"מ−1 ליחס של 1500 ס"מ−1 ליחס של 1500 ס"מ−1 הוגדר כאינדיקטור ל-OC (I1450 ס"מ−1/I1500 ס"מ−1), לאחר חיסור העוצמה ב-1700 ס"מ−1 (כרקע) מכל אחד משני הפסגות, בהתאמה, כמו בדיווחים קודמים, 17; ובשימושב-I 1606 ס"מ−1/I1666 ס"מ−1 כאינדיקטור ל-RP, הפחתה העוצמה ב-1700 ס"מ−1 (כרקע) מכל אחד משני הפסגות, בהתאמה. הערכים המחושביםI 1450 ס"מ−1/I1500 ס"מ−1 ו-I1606 ס"מ−1/I1666 ס"מ−1 נותחו כאינדקסטרים יחסיים שמקורם ב-SERS של תגובות הקשורות ל-OC ו-RP, בהתאמה. יחסים אלו שימשו להשוואת שינויים בין קבוצות ונקודות זמן תחת הגדרות רכישה זהות.
לא נקבעה עקומת כיול חיצונית במחקר הנוכחי להמרת יחסים אלו לריכוזים מוחלטים של מינים חמצוניים או לערכי פוטנציאל רדוקסיט אלקטרוכימיים מוחלטים. כל ספקטרום נרשם פעמיים בחמש נקודות שונות על גשושית SERS בשלוש דגימות משוחזרות. Origin שימש לעיבוד נתונים וליצירת תרשימים. כדי למזער שונות הקשורה לרכישה, הוחל על כל הקבוצות, אותו אורך גל לייזר, יעד, זמן רכישה, הגדרת עוצמת לייזר ועיבוד ספקטרלי. השפעות פוטותרמיות או פוטוכימיות הנגרמות על ידי הקרנת לייזר לא נמדדו באופן עצמאי ומוכרות כמגבלה. הנתונים הסטטיסטיים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). גודל המדגם והמבחן הסטטיסטי ששימש לכל ניסוי או לוח איור מוגדרים באגדות האיורים המתאימים. בניסויי אימות גלאי ex vivo שימשו בדשא SERS או במחט מיקרו-מוכנה באופן עצמאי כיחידת ניתוח. לניתוחי גלוקוז דם ומדדי SERS ב-in vivo , נעשה שימוש בעכבר כיחידת ניתוח ביולוגית. ספקטרום שנאספו ממספר נקודות על אותו גשוש טופלו כמדידות טכניות וממוצעו לפני ניתוח ברמת הקבוצה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת SPSS. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחנים סטטיסטיים שצוינו באגדות האיורים המתאימים. מדידות סוכר בדם בצום סדרתי ומדד SERS במהלך תקופת ההתערבות של 7 ימים פורשו כמגמות אורך חקרניות בשל גודל תת-הקבוצה הקטנה, ולא יושם מודל פורמלי של מדידות חזרות או השפעות מעורבות. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ייצור מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לזיהוי OC ו-RP
כדי לזהות שינויים ב-OC וב-RP, יוצרו מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS המכילות את הגשושים המתאימים. תמונות SEM מייצגות אישרו את המבנה הדו-חריצי של המחטים המיקרו-פעילות ב-SERS. איור 2A מציג את גוף מחט הדיקור עם שני חריצים חרוטים, איור 2B מציג חריץ טעון ב-GNS, ואיור 2C מציג תצוגה מורחבת של GNS המפוזר בתוך החריץ. תמונות ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פגיעה בסבילות לגלוקוז מייצגת שלב מעבר הפיך לפני סוכרת סוג 2 והיא קשורה קשר הדוק לחוסר איזון מטבולי, עמידות לאינסולין ולדיסרגולציה הקשורה ללחץ חמצוני. התערבות באורח החיים ואסטרטגיות טיפוליות מוקדמות אחרות יכולות להפחית את הסיכון להתפתחות מפגיעה בסבילות הגלוקוז לסוכרת, אך כלים למעקב דינמי אחר תגובות ביוכימיות מקומיות במהלך ההתערבות מוגבלים30. דווח כי דיקור סיני משפיע על מטבוליזם הגלוקוז ועל מסלולים הקשורים ללחץ חמצוני במחקרים ניסיוניים וקליניים. עם זאת, רוב המחקרים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
המחברים מודים לצוות מתקן בעלי החיים ופלטפורמת ההדמיה על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקטי מחקר ופיתוח מרכזיים של מחוז ג'יאנגסו ברפואה סינית (2020ZX05), פרויקטי מחקר ופיתוח מרכזיים במחוז ג'יאנגסו (BE2022684), פרויקט מדע וטכנולוגיה של מנהל המדינה לרגולציה של השוק (2022MK158), וקרן המדע-טכנולוגיה של סוז'ואו (SYW2024031).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A800524 | |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | M742544 | |
| חומצה אסקורבית | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CFAD310554 | |
| מד סוכר בדם | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe A03 | |
| רצועות בדיקת סוכר בדם | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe-A03-C | |
| סולפט נחושת (CuSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | PHR1477 | |
| אלכוהול אתיל (≥99.7%) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW00641752 | |
| סולפט ברזל (FeSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW01772078701 | |
| גלוקוז (Glu) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | D9434 | |
| מי חמצן (H2O2) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | P-17-0500 | |
| כלוריד ברזל (FeCl3) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CP81015228 | |
| מתיל מתאקרילט (MMA) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | M109626 | |
| ספקטרומטר ראמן מיקרו | Renishaw | InVia Raman Microscope | |
| p-פנילנדיאמין (p-PDA) | Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd. | P128784 | |
| פולימתיל מתאקרילט (PMMA) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | P742581 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים סורק | Zeiss | ULTRA Plus | |
| נתרן בורוהידריד (NaBH4) | Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd. | S432207 | |
| נתרן סולפיט (Na2SO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | S572396 | |
| מחטי אקופונקטורה מנירוסטה | Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd. | X-20-03 | |
| תוכנת ניתוח סטטיסטי | International Business Machines Corporation | Version 2021 | |
| סטרפטוזוטוצין (STZ) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | S408311 | |
| חומצה טטרכלורוזולטית (HAuCl4) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A124024 | |
| תוכנת SPSS | International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA | version 26.0 | |
| חולדות | Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd. | Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley | |
| מזון בסיסי | Anuokang Biotech. | SY10001 | |
| חזיר | MCE | HY-W127601 | |
| סוכרוז | MCE | HY-B1779 | |
| אבקת חלמון ביצה | MCE | HY-B2235B | |
| חומצת לימון מונו-הידראט | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| טריסודיום ציטראט די-הידראט | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| מאגר ציטראט | beyotime | P0086 | |
| מלח חומצת הזרחן | beyotime | ST448-1L | |
| איזופלורן | Bioss | D54468 | |
| מערכת הרדמה באיזופלורן לבעלי חיים קטנים | RWD Life Science | R500 | |
| תא אינדוקציה וחרוט אף | RWD Life Science | R500compatible accessories | |
| משטח חימום | Shanghai Yuyan Life Science | Y69020 | |
| 75% אתנול | Boyu Bio. | YB60401 | |
| תא סיום חיים בגז CO2 | Lab Animal Tec. Co. | LAT-10-0090 | |
| WPS | Beijing Kingsoft Office Software | WPS365 |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה