תהליך עבודה חישובי לתיעדוף גנים של המארח הקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים בתסמונת המעי הרגיז עם דומיננטיות של עצירות

סיכום

פרוטוקול זה משלב חיזוי יעדים של מטבוליטים מיקרוביאליים, טרנסקריפטומיקה של הרירית הרקטלית, אינטראקציה בין חלבונים להעשרה של מסלולים, עגינה מולקולרית (molecular docking), סימולציית דינמיקה מולקולרית והערכת אנרגיה חופשית של קישור באמצעות מכניקה מולקולרית/שטח פנים של פואסון-בולצמן (MM-PBSA), במטרה ליצור רשימה קצרה ומדורגת של גנים של המארח הקשורים למטבוליטים לצורך יצירת היפותזות, וקומפלקסים של חלבון-ליגנד בעדפות מבנית להמשך מעקב ניסיוני.

תקציר

לא קיים צינור חישובי סטנדרטי לתיעדוף שיטתי של גנים של המארח הקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים ושל קומפלקסים של חלבון-ליגנד מתוך מאגרי נתונים כימיים, גנומיים ומבניים הזמינים לציבור. מאמר זה מתאר זרימת עבודה בת שמונה שלבים, המקבלת קבוצה של מטבוליטים המופקים מחיידקי המעי שמוגדרת על ידי המשתמש, ומפיקה רשימה מדורגת ומקוצרת של גנים מועמדים של המארח הקשורים למטבוליטים, מסלולים ביולוגיים מועשרים, וקומפלקסים של חלבון-ליגנד מתועדפים מבנית להמשך מעקב ניסיוני. צינור העבודה משלב (i) פרופיל מטבוליטים כימואינפורמטי; (ii) חיזוי מטרות מועמדות מתוך מספר מאגרי נתונים באמצעות כלי לחיזוי מטרות המבוסס על ליגנדים ואינטראקציה בין חלבון לכימיקלים ותוכנה לעגינה מולקולרית (molecular docking); (iii) ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי של נתונים טרנסקריפטומיים הזמינים לציבור; (iv) חפיפת מטרות עם גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי; (v) בניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרת מסלולים; (vi) עגינה מולקולרית באמצעות תוכנה לעגינה מולקולרית; (vii) סימולציית דינמיקה מולקולרית של 200 ns באמצעות מנוע דינמיקה מולקולרית עם שדה כוחות חלבון המשמש לסימולציות דינמיקה מולקולרית; ו-(viii) הערכת אנרגיה חופשית של קישור בשיטת MM-PBSA. כדוגמה מעשית, תשעה מטבוליטים המופקים מחיידקי המעי או שונו על ידיהם, המייצגים חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות מרה, מטבוליטים המופקים מטריפטופן ו-urolithin A, עובדו באמצעות מאגר הנתונים הטרנסקריפטומי הציבורי GSE36701 של רירית רקטום במצבי IBS-C. זרימת העבודה דירגה 17 גנים ייחודיים שנחזו כקשורים למטבוליטים אשר הראו ביטוי דיפרנציאלי במערך נתונים זה. ניתוחי עגינה, סימולציית דינמיקה מולקולרית ו-MM-PBSA תיעדו מבנית חמישה קומפלקסים של מטבוליט-חלבון: lithocholic acid-VDR, lithocholic acid-NR1H4/FXR, ursodeoxycholic acid-NR1H4/FXR, tryptamine-HTR2A (שסומולץ בשכבה כפולה של ליפידים מסוג 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) מפורשת), ו-urolithin A-CASP3. הפרוטוקול תוכנן להיות ניתן להתאמה לקבוצות מטבוליטים אחרות, למאגרי נתונים טרנסקריפטומיים של מחלות ולסוגי מטרות שונים; כל הפלטים הם תחזיות חישוביות המייצרות היפותזה, הדורשות שכפול טרנסקריפטומי עצמאי, תיקוף ברמת החלבון ובדיקות תגובה פונקציונלית לליגנד לפני שניתן להסיק מסקנות סיבתיות או טיפוליות.

מבוא

תסמונת המעי הרגיז עם עצירות (IBS-C) היא הפרעה תפקודית נפוצה של מערכת העיכול, המתאפיינת בכאבים בטניים חוזרים, שינוי בהרגלי היציאות, נפיחות ועצירות, כאשר השכיחות העולמית מוערכת בכ-10–15% מהאוכלוסייה הכללית^1,2. טיפולים פרמקולוגיים נוכחיים, הכוללים חומרים מעוררי הפרשה (secretagogues), פרוקינטיקה ותרופות נוגדות עוויתות, עשויים לשפר תסמינים בודדים בחלק מהמטופלים; עם זאת, התגובה לטיפול נשארת הטרוגנית והשגה של רמיסיה בר-קיימא היא נדירה, דבר המשקף את הפתופיזיולוגיה המורכבת והרב-גורמית של המצב^1,3,4. לפיכך, נדרשה הבנה מכניסטית מלאה יותר של האופן שבו אותות מיקרוביאליים במעי מועברים ברמת הרירית, כדי להגדיר היפותזות הניתנות לבדיקה עבור יעדים טיפוליים חדשניים.

מיקרוביוטת המעי תורמת להומיאוסטזיס של מערכת העיכול התחתונה באמצעות ייצור וביוטרנספורמציה של מטבוליטים מגוונים מבחינה כימית, כולל חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs), חומצות מרה משניות, תרכובות נגזרות מטריפטופן ומטבוליטים נגזרים מפוליפנולים כגון אורוליתינים^5,6,7,8. מולקולות אלו מתקשרות עם תאי המאכסן דרך רפרטואר רחב שטרם אופיין במלואו של מטרות מולקולריות, אשר חורג הרבה מעבר לקולטני קרום קנוניים להסנס של מטבוליטים וכולל קולטנים גרעיניים, אנזימים ציטוזוליים, חלבונים המשנים היסטונים, מקדימים להורמונים פפטידיים וחלבונים של העברה תוך-תאית⁹. הרכבי קהילה מיקרוביאלית של המעי ופרופילי מטבוליטים משתנים תועדו בחולים עם תסמונת המעי הרגיז (IBS), מה שמספק רציונל ביולוגי לבדיקה האם גנים של המאכסן הקשורים לתגובה למטבוליטים מיקרוביאליים הם בעלי הפרעה תעתוקית ברירית הרקטום ב-IBS-C¹⁰.

פאנל תשעת המטבוליטים הוגדר מראש כדי לספק קבוצה תמציתית, מגוונת כימית וניתנת לפירוש ביולוגי של מולקולות קטנות המופקות על ידי מיקרוביומת המעי או משתנות על ידו. הבחירה התבססה על חמישה קריטריונים: ייצוג של מחלקות מטבוליטים מיקרוביאליות עיקריות המעורבות באותוות בין המארח למיקרוביומה; חשיפה ידועה או סבירה של הרירית במעי הרחוק; זמינות של מזהי PubChem חד-משמעיים ומבנים קנוניים; גודל מולקולרי ויכולת טיפול מבנית לניבוי מטרות מבוסס-ליגנד וסימולציית docking; וסבירות מוקדמת לאותוות הקשורה לתאי אפיתל, למערכת הנוירו-אימונית, לתאים אנטרואנדוקריניים, לקולטנים גרעיניים או לתנועתיות ב-IBS-C. הפאנל שנבחר כלל butyrate ו-propionate כ-SCFAs; chenodeoxycholic acid, lithocholic acid ו-ursodeoxycholic acid כחומצות מרה; tryptamine, indole-3-propionic acid ו-indole-3-lactic acid כמטבוליטים נגזרות טריפטופן; ו-urolithin A כמטבוליט פוליפנולי המופק על ידי מיקרוביומת המעי^5,6,7,8,9,10.

מרבית המחקריםBחישוביים והניסויים הקודמים בחנו זוגות בודדים של מטבוליט–רצפטור או מטבוליט–אנזים בבידוד, גישה שאינה לוכדת את הטבע המבוזר והמתכנס של סיגנלינג מטבוליטים מיקרוביאליים על פני מסלולי המארח^9,11. שילוב של מספר שלבים אנליטיים מעניק כוח סינון הדדי ומחזק ששום שלב בודד אינו יכול לספק באופן עצמאי. חיזוי חישובי של מטרות מול מאגרי מידע מאושרים מניב קבוצה רחבה של חלבוני מארח מועמדים עבור כל מטבוליט. חיתוך עם נתונים טרנסקריפטומיים רלוונטיים למחלה מסנן באופן משמעותי קבוצה זו, תוך השארת מועמדים שרק התמלילים שלהם השתנו בהקשר של המחלה. ניתוחים של העשרת מסלולים ורשתות אינטראקציה בין חלבונים ממפים לאחר מכן את רשימת המועמדים המצומצמת למודולים ביולוגיים ידועים. עגינה מולקולרית (Molecular docking) מספקת הערכה חישובית ראשונית של השלימתיות של כיס הקשירה עבור כל קומפלקס מועמד, וסימולציית דינמיקה מולקולרית (MD) נוספת של 200 ns עם פירוק אנרגיה חופשית של קשירה בשיטת MM-PBSA מספקת ממד תרמודינמי ותלוי-זמן לתעדוף מבני שאינו זמין מצייוני עגינה בלבד. ביצוע כל שלב באופן עצמאי, ללא שילוב שיטתי וסינון רצופי, יביא לרשימות מועמדים רחבות מדי מכדי שניתן יהיה לבחון אותן ניסויית, ויכשיל את הזיהוי של ארכיטקטורת מסלולים מתכנסת.

במסגרת פרוטוקול זה, במונח "גן הקשור למטבוליט" (MAG), הכוונה היא לגן אנושי, שמוצר החלבון שלו הוגדר כמטרה מולקולרית משוערת של אחד או יותר ממטבוליטים שמקורם במיקרוביוטת המעי על ידי לפחות מאגר נתונים אחד של חיזויי חישוב מאושרים, וששכפול התעתקו (transcript) שלו מבוטא באופן דיפרנציאלי במערך הנתונים הטרנסקריפטומי הרלוונטי למחלה ששימש להדגמת זרימת העבודה. הגדרה אופרטיבית זו כוללת במכוון קולטנים של ממברנה בתוספת קולטנים גרעיניים, אנזימים ציטוזוליים, חלבוני איתות, מקדימי הורמונים פפטידיים וחלבוני תאי-פנים אחרים. הגדרה כ-MAG אינה מהווה ראיה ניסיונית לכך שמטבוליט נקשר, יוצר קומפלקס חלבון-ליגנד, מפעיל קולטן, משנה את שכיחות החלבון או גורם למחלה, אלא היא הגדרה שהופקה בחישוב לצורך יצירת השערות, אשר דורשת תיקוף ניסיוני.

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה החישובית המלאה בת שמונת השלבים (איור 1) עם פירוט תפעולי מספיק כדי לאפשר שכפול עצמאי, התאמה לפאנלים אחרים של מטבוליטים או למערכי נתונים של מחלות, והרחבה להקשרים אחרים של אינטראקציות בין מאחס למיקרוביוטה. זרימת העבודה מוגדרת במפורש כמסגרת להצגת היפותזות ותיעדוף מבני, הפועלת אך ורק על משאבי אומניקה ומשאבים מבניים הזמינים לציבור, ואינה מסיקה ריכוזי מטבוליטים משתנים, מצבי הפעלה של רצפטורים, שינויים בביטוי חלבונים, פעילות סיגנלינג במורד הזרם או משמעות קלינית מתוצאות חישוביות בלבד. כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול כדוגמה מעשית באמצעות תשעה מטבוליטים המופקים ממיקרוביוטת המעי או משתנים על ידיה, ומתוך מערך הנתתים הטרנסקריפטומיים הציבוריים GSE36701 של רירית הרקטום ב-IBS-C, במטרה לזהות MAGs ולתעדף קומפלקסים של מטבוליט–חלבון לצורך מעקב ניסויי בהמשך.

פרוטוקול

הניתוח השתמש אך ורק בנתוני טרנסקריפטומיקה מזוהים באופן אנונימי שהיו זמינים לציבור מ-GSE36701, ובמאגרי מידע כימיים, חלבוניים ומבניים שהיו זמינים לציבור. הגישה למאגרי המידע התבצעה בין ינואר למאי 2026. כל תאריך גישה מאוחר יותר תועד ב- טבלת חומרים נפרדת.

1. דרישות תכנון המחקר, חומרה ותוכנה

1. הגדירו את זרימת העבודה לפני תחילת הניתוח. השתמשו בשמונה שלבים: בחירת מטבוליטים, חיזוי מטרות, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, חפיפה בין מטרות לגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEG), העשרה של מסלולים/אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI), עגינה מולקולרית (molecular docking), סימולציית MD, והערכת MM-PBSA.
2. רשמו כי עגינה, MD ו-MM-PBSA הם כלי תיעדוף מבניים בלבד. אין לפרש פלטים אלו כראיה ניסויית לקשירה, להפעלת רצפטור, לשינוי בשפע של חלבון, ליעילות טיפולית או לסיבתיות של מחלה.
3. אשרו את חומרת המחשוב לפני הרצת סימולציות MD. השתמשו במערכת הפעלה Linux של 64-ביט, מעבד עם 6 ליבות ומעלה, פלטפורמת האצה באמצעות GPU עם ≥8 GB VRAM, או פלטפורמת האצה מקבילה עם ≥8 GB VRAM, מינימום 32 GB RAM, ולפחות 200 GB שטח אחסון פנוי לכל מערכת MD.
4. רשמו את התוכנות המרכזיות: מנוע דינמיקה מולקולרית, תוכנה לעגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה, תוכנה להמרת פורמט של קבצים כימיים¹², תוכנה ליצירת ליגנדים תלת-ממדיים, תוכנה להכנת ליגנדים, ערכת כלים להכנת קלט לעגינה, תוכנה לעגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה, סביבת תכנות כללית, סביבת מחשוב סטטיסטי עם תשתית תוכנה לביואינפורמטיקה, וחבילה לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי.
5. רשמו את כלי הניתוח המבני: כלי מבוסס רשת לבניית מערכות ממבנה, שירות פרמטריזציה של ליגנדים תואם CHARMM, כלי לחישוב אנרגיית קשירה באמצעות מכניקה מולקולרית/ממס Solvent רציף, ספרייה להמרת פרמטרים וטופולוגיה מולקולרית, תוכנה לוויזואליזציה מולקולרית תלת-ממדית, וכלי לוויזואליזציה מולקולרית ולדיאגרמת אינטראקציות דו-ממדית 2021 (ראו טבלת חומרים עבור קישורי הורדה ומידע על גרסאות).
6. רשמו בטבלת החומרים/קובץ הסביבה את מזהי הגרסאות המדויקים של שדה הכוח החלבוני שבו נעשה שימוש לסימולציות דינמיקה מולקולרית, CGenFF, CHARMM-GUI, תשתית תוכנת R/ביואינפורמטיקה, וכלי לחישוב אנרגיית קשירה באמצעות מכניקה מולקולרית/ממס Solvent רציף. סמנו מזהים חסרים כ-"not recoverable"; אל תסיקו אותם.

2. בחירת מטבוליטים ואפיון כימואינפורמטי

1. הגדירו את פאנל המטבוליטים לפני חיזוי המטרה. כללו butyrate (PubChem CID: 264), propionate (CID: 1032), chenodeoxycholic acid (CID: 10133), lithocholic acid (CID: 9903), ursodeoxycholic acid (CID: 31401), tryptamine (CID: 1150), indole-3-propionic acid (CID: 3744), indole-3-lactic acid (CID: 92904), ו-urolithin A (CID: 5488186).
2. שלופו את ה-SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) הקנוני ואת ה-PubChem CID עבור כל מטבוליט. ודאו שמות נרדפים ומבנים כפולים לפני חיזוי המטרה. שמרו את המזהים הסופיים בגיליון המטבוליטים הראשי.
3. הזינו את מחרוזות ה-SMILES הקנוניות לכלי הרשת לחיזוי תכונות פיזיקו-כימיות ו-ADME¹³ (ראו טבלת חומרים). רשמו את המשקל המולקולרי, שטח הפנים הפולרי הטופולוגי (TPSA), consensus logP, תורמי קשרי מימן, מקבלי קשרי מימן, קשרים סיבוביים, ספיגה גסטרו-אינטסטנלית חזויה, חיזוי P-glycoprotein, והתרעות Lipinski, Veber, Ghose, Egan, Muegge ו-PAINS.
4. שמרו מטבוליטים עם זיהוי מבנה מוצלח, משקל מולקולרי ≤500 Da, וללא התרעות PAINS. רשמו כל קריטריון שלא עמד בדרישות ואת ההחלטה לשמר או להסיר את המטבוליט.
5. קבעו את מצבי היונון לפני חיזוי המטרה ועגינה (docking). השתמשו בקבוצות קרבוקסילט דה-פרוטוניות עבור butyrate ו-propionate, בצורות חומצה קרבוקסילית ניטרליות עבור חומצות מרה, באמוניום פרוטוני עבור tryptamine, ובצורות ניטרליות עבור שאר המטבוליטים.

3. חיזוי מטרות אנושיות פוטנציאליות

1. פתחו כלי לחיזוי מטרות אינטראקציה בין כימיקלים לחלבונים¹⁴ (ראו טבלת החומרים). הזינו את שם כל מטבוליט או את ה-PubChem CID שלו, בחרו ב-Homo sapiens (מזהה טקסונומיה: 9606), והגדירו את ציון האינטראקציה המשולב המינימלי ל-≥0.700.
2. תעדפו ערוצי ראיות של ניסויים ומסדי נתונים מאושרים (curated) בכלי לחיזוי מטרות אינטראקציה בין כימיקלים לחלבונים. הורידו את טבלת השיוּך המלאה של החלבונים עבור כל מטבוליט.
3. פתחו תוכנה לעגינה מולקולרית (molecular docking)¹⁵ (ראו טבלת החומרים). הזינו כל מחרוזת SMILES קנונית כאשר נבחר Homo sapiens, ושמרו מטרות עם הסתברות של ≥0.70.
4. מזג את התוצאות של כלי חיזוי מטרות האינטראקציה בין כימיקלים לחלבונים ותוכנת העגינה המולקולרית כקבוצת איחוד עבור כל מטבוליט. שמרו כל מטרה שעומדת באחד מספי השבירה של מסדי הנתונים והסירו כניסות כפולות של סמלי גנים זהים.
5. סטנדרטו את רשומות החלבונים לסמלי גנים מאושרים על ידי ועדת השמות של הגנים האנושיים (HGNC) באמצעות מיפוי מזהי חלבונים לסמלי גנים סטנדרטיים מאושרים על ידי HGNC או באמצעות מסד הנתונים המשולב למידע על גנים אנושיים (ראו טבלת החומרים). פתרו כינויים (aliases), סמלים מיושנים והערות איזופורמים לסמל גן אחד לכל חלבון.
6. סווגו כל מטרה כקולטן ממברנה, קולטן גרעיני, אנזים, חלבון איתות תוך-תאי, הורמון פפטידי, חלבון הקשור להורמונים או חלבון תוך-תאי אחר. רשמו את הסיווג בטבלת המטרות.

4. מערך נתונים טרנסקריפטומי וניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי

1. גשו למספר GSE36701 באמצעות הכלי המקוון של NCBI לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי^16,17 (ראה טבלת חומרים). רשום כי מערך הנתונים כולל נתוני ביטוי של ביופסיות של רירית הרקטום מקבוצות של IBS-C, תסמוימת המעי הרגיז עם שלשול (IBS-D), IBS לאחר זיהום ומתנדבים בריאים.¹⁸.
2. חפשו ב-GEO וב-ArrayExpress קבוצת תיקוף (validation cohort) בלתי תלויה. השתמשו בשילובים של IBS-C, תסמוכת המעי הרגיז עם דומיננטיות של עצירות (constipation-predominant irritable bowel syndrome), רירית הרקטום (rectal mucosa), רירית המעי הגס (colonic mucosa), ביופסיה, טרנסקריפטום, מערך מיקרו (microarray) ו-RNA-seq. רשמו את המאגרים, את מונחי החיפוש, את תאריך החיפוש והאם זוהה מערך נתונים להשוואה לצורך תיקוף.
3. הפעל את הכלי המקוון לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי מרשומת GSE36701 (ראה טבלת חומריםהקצו את 18 דגימות ה-IBS-C לקבוצת ה-IBS-C, הקצו את 40 המתנדבים הבריאים לקבוצת הביקורת, והשאירו את דגימות ה-IBS-D וה-IBS לאחר זיהום ללא הקצאה.
4. בצעו ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות מסגרת חבילת הניתוח לביטוי גנים דיפרנציאלי עם תיקון שיעור גילוי שגוי (FDR) לפי שיטת Benjamini-Hochberg¹⁹הורד את טבלת התוצאות המלאה הכוללת את מזהה הגשוש (probe ID), סמל הגן (gene symbol), שם הגן (gene title), ערך logFC, ביטוי ממוצע (AveExpr), סטטיסטי t ממותנת (moderated t-statistic), ערך P גולמי וערך P מתוקנן.
5. אחד את הגששים (probes) לכניסות ברמת הגן. הסר גששים שחסרים להם סמלי גנים; עבור סמלים כפולים, שמור את הגשש בעל ה-FDR הנמוך ביותר; ובמקרה של תיקו, השתמש בערך ה-logFC המוחלט הגבוה יותר.

5. ניתוח חפיפת מטרה-דרג (target-deg) והערכה סטטיסטית

1. בצעו חיתוך (Intersect) בין כל רשימת המטרות החזויות הספציפיות למטבוליט לבין רשימת ה-DEG ברמת הגן ב-FDR < 0.05. רשמו את הגנים החופפים, המטבוליט ממנו מקורם, את ה-logFC, את ה-P-value המתוקנן ואת כיוון הביטוי.
2. מזגו את רשימות החפיפה הספציפיות למטבוליטים לרשימת MAG לא-redundant. ספרו את סך המטרות החזויות, את החפיפות הספציפיות למטבוליטים ואת סך ה-MAGs הייחודיים.
3. העריכו את העקביות הכיוונית ברמת הגש (probe-level) עבור גנים עם מספר גשים. סמנו כל גן שבו הגשים אינם תואמים בכיוון הביטוי.
4. בנו את טבלת הסמיכות לבדיקת Fisher’s exact test באמצעות סך הEntries המאוחדים ברמת הגן, סך ה-DEGs, סך המטרות החזויות הייחודיות ו-MAGs שנצפו. חשבו את ה-P-value החד-צדדי, את יחס הסיכויים (odds ratio) ואת רווח הסמך של 95% באמצעות יישום ה-Fisher’s exact test.
5. אם שיעור ה-DEG ברקע עולה על 50%, דווחו על החפיפה כתיאורית ולא כהעשרה (enrichment) המהווה תיקוף עצמאי. התייחסו להורדה אחידה בביטוי (uniform downregulation) כדפוס כיווני תיאורי, אלא אם בוצע מבחן כיווניות נפרד.

6. ניתוח רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרה של מסלולים

1. העבירו את רשימת ה-MAG הייחודית והמלאה לבניית רשת אינטראקציות בין חלבונים ולהעשרת מסלולים²⁰ (ראו טבלת חומרים). בחרו ב-Homo sapiens והגדירו את ציון האינטראקציה המינימלי ל-0.700.
2. ייצאו את הרשת המשולבת של בניית רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים ואת טבלת האינטראקציות המלאה. אם כריית טקסט (text-mining) מייצרת טופולוגיה צפופה באופן מלאכותי, בטלו את הבחירה בטקסט-מיינינג והשאירו את הערוצים הניסויים, ערוצי הביטוי המשותף (co-expression) וערוצי מסדי הנתונים.
3. ייצרו תתי-רשתות של מחלקות מטבוליטים עבור MAGs הקשורים ל-SCFA, לחומצות מרה ולטריפטאמין/סרוטונין. השתמשו באותן הגדרות של אורגניזם ורמת ביטחון כפי שהוגדרו בבניית רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים.
4. הריצו בנייה של רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים מול Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)²¹, Reactome²², ו-Gene Ontology (GO) Biological Process^23,24. החילו Benjamini–Hochberg BH FDR <0.05 וייצאו את כל טבלאות ההעשרה.

7. עגינה מולקולרית (Molecular docking)

1. שלוף מבני רצפטורים שנקבעו ניסיונית ממאגר החלבונים של Research Collaboratory for Structural Bioinformatics RCSB PDB²⁵ (ראה טבלת חומרים). השתמש ב-VDR/1DB1, NR1H4/FXR/3DCT, CASP3/2DKO, ו-HTR2A/6A93 עבור חמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד בעדיפות גבוהה.
2. הכן כל רצפטור על ידי השארת שרשרת A והסרה של מים, ליגנדים שגובשו יחד, קו-פקטורים, יונים ורשומות HETATM שאינן חלבון. עבור 6A93, הסר את סגמנט היתוך ה-T4 lysozyme לפני הכנת הרצפטור.
3. הוסף מימנים פולריים, הקצה מטעני Gasteiger, ושמור כל רצפטור כ-PDBQT באמצעות ערכת כלי המבנה המולקולרי. בחן את מצבי הפרוטונציה של ההיסטידין באתר הקשירה לפני ההמרה ל-PDBQT ותעד את המצבים שנבחרו.
4. צור מבנה תלת-ממדי עבור כל ליגנד בערכת כלי המרת קבצי המבנה הכימי. בצע מזעור אנרגיה עם Universal Force Field (UFF) למשך 500 שלבים, הקצה מצב יינון עבור pH 7.4, הקצה מטעני Gasteiger, ושמור כ-PDBQT.
5. הגדר תיבת עגינה (docking box) בגודל 25 Å x 25 Å x 25 Å הממורכזת על המרכז (centroid) של הליגנד שגובש יחד. השתמש במרכזים (10, 19, 33) עבור VDR, (137, 31, 78) עבור FXR, (37, 34, 32) עבור CASP3, ו-(12, −1, 61) עבור HTR2A.
6. הרץ עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבונים המטרה^26,27 עם exhaustiveness = 8, seed = 42, num_modes = 9, ו-energy_range = 3 kcal/mol. רשום את ציון ה-Vina הגבוה ביותר וערכי Root-mean-square deviation (RMSD) עבור כל הפוזות (poses).
7. בחר את mode 1 עבור כל קומפלקס בעדיפות גבוהה. צור דיאגרמות דו-ממדיות של ליגנד-שארית באמצעות כלי הדמיה מולקולרית וכלי דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, ותצוגות תלת-ממדיות של רצפטור-ליגנד בתוכנה להדמיה מולקולרית תלת-ממדית.
8. בצע בקרות של עגינה חוזרת (redocking) עבור VDR/1DB1 ו-FXR/3DCT. קבל את הגדרות העגינה של הרצפטור כאשר RMSD של האטומים הכבדים הוא <2.0 Å ביחס לפוזה הקריסטלוגרפית.
9. בצע בקרות עגינה צולבת (cross-docking) על ידי עגינה של Lithocholic acid (LCA) לתוך CASP3 ושל tryptamine לתוך VDR. השווה בין ציונים קוגנאטיים ולא קוגנאטיים ורשום מקרים שבהם הפרש הציונים הוא <1.0 kcal/mol.

8. סימולציית דינמיקה מולקולרית

1. הפק פרמטרי ליגנד באמצעות שירות פרמטריזציה של ליגנדים התואם ל-CHARMM²⁸ (ראה טבלת חומרים). בחן את כל ציוני העונש (penalty scores) וסמן כל פרמטר עם עונש >50.
2. המיר קבצי זרם (stream files) של הליגנד לקבצי .itp ו- .prm התואמים למנוע הדינמיקה המולקולרית באמצעות סקריפט להמרה של טופולוגיית שדה הכוחות. שלב את קבצי הטופולוגיה של הליגנד והחלבון עבור כל קומפלקס.
3. בצע חלוקה מחדש של מסת המימן (hydrogen mass repartitioning) באמצעות ספריית המרה של טופולוגיה מולקולרית ופרמטרים. הפק טופולוגיות מימיות עם שדה הכוחות של החלבון ששימש לסימולציות דינמיקה מולקולרית²⁹ ומודל מים מפורש בעל שלושה אתרים³⁰.
4. בצע סולבציה (solvate) לקומפלקסים המימיים בתיבה דודקאהדרלית עם מרווח של לפחות 1.2 nm בין הממס לקצוות. נטרל את המערכות והוסף NaCl עד לריכוז של 0.15 M.
5. בנה את מערכת ממברנת ה-tryptamine-HTR2A באמצעות כלי בניית מערכת ממברנה מבוסס רשת^31,32,33 (ראה טבלת חומרים). השתמש בקואורדינטות רצפטור המיושרות למסד נתונים של אוריינטציית ממברנה-חלבון³⁴ (ראה טבלת חומרים), שכבת דו-שכבתית של POPC טהור, שכבות מים של 22.5 Å ו-0.15 M NaCl.
6. בצע מינימום אנרגיה לכל המערכות בשיטת steepest descent עד ל-50,000 צעדים. אשר התכנסות ב-Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1 לפני שלב השיווי.
7. בצע שיווי (equilibration) למערכות המימיות בשלבי אנסמבל של מספר חלקיקים, נפח וטמפרטורה קבועים (NVT) ואנסמבל של מספר חלקיקים, לחץ וטמפרטורה קבועים (NPT). בצע שיווי למערכת הממברנה באמצעות זרימת עבודה מבוססת רשת להכנה ושיווי של מערכות מולקולריות רב-שלבית בת ששב שלבים עם שחרור הדרגתי של אילוצים.
8. הרץ סימולציית MD ייצור למשך 200 ns עבור כל חמשת הקומפלקסים. השתמש בצעד זמן (timestep) של 4 fs עם חלוקת מסת מימן (HMR), תרמוסטט V-rescale ב-310 K, ברוסטט Parrinello-Rahman ב-1 bar, אלקטרוסטטיקה של Particle mesh Ewald (PME)³⁵ ואילוצי LINCS³⁶.
9. נתח את המסלולים (trajectories) הסופיים באמצעות כלי ניתוח מסלולי דינמיקה מולקולרית. חשב RMSD של השלד (backbone), תנודה ממוצעת ריבועית (RMSF) של Cα, רדיוס גירהציוני, שטח פנים נגיש לממס (SASA) וקשרי מימן בין חלבון לליגנד, כאשר 150 ns האחרונים ישמשו כחלון הניתוח העיקרי.

9. הערכת אנרגיה חופשית של קישור בשיטת MM-PBSA

1. חלץ צילומי מסך (snapshots) של המסלול עבור אנליזת MM-PBSA. השתמש ב-2,001 פריימים עבור כל קומפלקס מימי וב-201 פריימים מעובדים עבור תת-המערכת של HTR2A המוטמעת בממברנה.
2. הפעל את הכלי לחישוב אנרגיית קישור באמצעות מכניקה מולקולרית/ממס solvent רציף³⁷ עם סולבציה מסוג Poisson-Boltzmann, קבוע דיאלקטרי פנימי = 1, קבוע דיאלקטרי חיצוני = 80, סולבציה לא פולרית מבוססת SASA, וללא תיקון אנטרופיה. דווח על ממוצע האנרגיה החופשית של הקישור ועל סטיית התקן.
3. בצע פירוק לפי שארית (per-residue decomposition) עבור כל חמשת הקומפלקסים. דווח על השאריות המייצבות והמערערות בעלות תרומה מוחלטת של ≥0.5 kcalmol⁻¹.

    

תוצאות

מטרות פוטנציאליות הקשורות למטבוליטים

תשעת המטבוליטים הניבו קבוצות מטרות חזויות הטרוגניות באמצעות תוכנית לחיזוי אינטראקציות כימי-חלבון ותוכנית לעיגון מולקולרי (molecular docking). פרופיონאט, טריפטמין, חומצות מרה ואורוליתין A הניבו מספר מטרות בעלות רלוונטיות ידועה לאיתות במערכת העיכול. נוף המטרות החזויות כלל קולטנים קנוניים בממברנה, קולטנים גרעיניים, אנזימים תוך-תאיים, חלבוני איתות וחלבונים הקשורים להורמוני פפטיד. לפיכך, תוצאות במורחב (downstream) מתוארות כגנים הקשורים למטבוליטים (MAGs) ולא כממצאים של קולטנים בלבד (טבלה 1).

השוואה מול אינטראקציות מטבוליט-חלבון מדווחות

כדי להשוות את פלט חיזוי המטרות לידע ניסיוני קיים, סווגו קשרי מטרה צפויים הקשורים למטבוליטים לשלוש רמות של ראיות: (i) אינטראקציות ישירות או קרובות ברמת המחלקה בין מטבוליט לחלבון הנתמכות ניסיונית, שבהן דווח כי המטבוליט או מטבוליט אנדוגני קרוב קושר, מפעיל, מעכב או מווסת תפקודית את החלבון המקודד; (ii) אינטראקציות הנתמכות על ידי מסלול או מחלקת מטרה, שבהן המטרה הצפויה שייכת למסלול תגובתי למטבוליטים או למשפחת קולטנים מבוססת, אך הראיות הישירות עבור הזוג הספציפי של מטבוליט-חלבון מוגבלות; ו-(iii) התאמות מבוססות חישוב בלבד, עבורן לא זוהתה אינטראקציה ניסיונית ישירה בספרות שנסקרה. השוואה זו שימשה כדי לתת הקשר, ולא כדי לתקף, את ה-MAGs שנחזו.

מספר תחזיות שחזרו ביולוגיה שדווחה בעבר. האינטראקציה Propionate-FFAR2 נחשבה כנתמכת ניסויית מכיוון ש-FFAR2/GPR43 הוא קולטן קנוני לחומצות שומן קצרות שרשרת. האינטראקציה Butyrate-HDAC3 סווגה כנתמכת ניסויית או נתמכת-מחלקה (class-supported) מכיוון שבוטיראט הוא מעכב מוכר של היסטון דה-אצטילאז, והחפיפה החזויה כללה חבר במשפחת ה-HDAC. תחזיות הקשורות לחומצות מרה הכוללות את NR1H4/FXR ו-VDR נחשבו כנתמכות על ידי הביולוגיה המוכרת של קולטני גרעין לחומצות מרה, במיוחד עבור חומצות מרה הידרופוביות כגון LCA; תחזיות FXR הקשורות לחומצה אורסודיאוקסיכולית (UDCA) פורשו בזהירות מכיוון ש-UDCA היא בדרך כלל ליגנד חלש יותר של FXR או תלויה בהקשר. תחזיות הקשורות לטריפטאמין עבור HTR1B, HTR2A, HTR2B ו-HTR6 סווגו כנתמכות על ידי מסלול סרוטונירגי ולא כאינטראקציות ישירות ומאושרות ספציפיות לקולטן, מכיוון שטריפטאמין הוא מונואמין מיקרוביאלי נגזר טריפטופאן וקולטני סרוטונין הם רגולטורים מוכרים של מוטיליות והפרשה במערכת העיכול. האינטראקציה Urolithin A-CASP3 נחשבה כנתמכת-מסלול על סמך קשרים שפורסמו בין urolithin A לתגובות אפופטוטיות/קשורות לקספאזה, אך לא על סמך ראיה ישירה לקשירה של CASP3. האינטראקציות Indole-3-lactic acid-KYAT1 ו-indole-3-propionic acid-KYAT1 נשמרו כהיפותזות חישוביות בלבד, מכיוון שהספרות הרחבה תומכת באיתות של המארח על ידי נגזרות אינדול מיקרוביאליות, אך לא בקשירה ישירה של KYAT1 על ידי מטבוליטים מדויקים אלה^7,8,38,39,40.

בהתאם לכך, טבלה 1 מבדילה בין הגדרת המטרה החישובית לבין רמת התמיכה הניסויית או תמיכת המסלול המוקדמת. היא מספקת גם, עבור כל מטרה, את מקור החיזוי (חיזוי מטרה לאינטראקציה כימית-חלבון, תוכנת עגינה מולקולרית (molecular docking), או שניהם), את ציון האינטראקציה המשולב עבור חיזוי המטרה לאינטראקציה כימית-חלבון, ואת ההסתברות בתוכנת העגינה המולקולרית כאשר המטרה זוהתה על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. מטרות שחוזו ללא ראיה ניסויית מוקדמת ישירה מתוארות כגנים מועמדים הקשורים למטבוליטים, הדורשים תיקוף עצמאי ברמת החלבון ותגובת ליגנד.

חפיפה בין המטרות החזויות לבין גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי ב-IBS-C

חיתוך רשימות המטרות החזויות המשולבות עם תוצאות הביטוי הדיפרנציאלי ברמת הגן זיהה 17 גנים ייחודיים חזויים הקשורים למטבוליטים, שהפגינו ביטוי דיפרנציאלי מובהק בהשוואה בין IBS-C למתנדבים בריאים. כל 17 הגנים היו בעלי ביטוי מופחת (downregulated). קבוצה זו כללה רצפטורים של ממברנה ושל הגרעין (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) וחלבונים שאינם רצפטורים (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) (טבלה 1, איור 2A,B).

כל 17 ה-MAGs עמדו בסף שיעור גילויים שגוי (FDR) נמוך מ-0.05; 16 מתוך 17 עמדו ב-FDR מחמיר יותר של < 0.001, כאשר הגן שנותר (HTR1B) היה מובהק ב-FDR < 0.05. שבעה מתוך 17 המטרות (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R) עמדו הן ב-FDR < 0.001 והן בשינוי קיפול (fold change) מוחלט של log₂ העולה על 1.0 (טווח logFC בין −1.34 ל-−1.10), מה שמעיד על דכירה (downregulation) חזקה ועקבית עבור תת-קבוצה זו. שאר המטרות הראו דכירה מתונה אך מובהקת סטטיסטית (|logFC| בטווח של 0.45 עד 0.97). תבנית תיאורית אחידה זו פורשה בזהירות, בהתחשב במאפייני הביטוי של מערך הנתונים ברחבי הגנום (ראה הערכה סטטיסטית להלן).

הערכה סטטיסטית של חפיפת ה-DEG המטרה

כדי להעריך באופן פורמלי את המובהקות הסטטיסטית של החפיפה של 17 הגנים, הוחל מבחן מדויק של פישר (Fisher’s exact test) חד-זנבי, כאשר 17 הגנים הממומנים כמטרות שימשו כקבוצת השאילתה וכל 18,296 הרשומות הייחודיות המקובצות לפי גן (gene-collapsed) שזוהו ב-GSE36701 שימשו כרקע הגנומי. מתוך רקע זה, 17,296 גנים (94.5%) הראו ביטוי דיפרנציאלי ב-FDR < 0.05, מה שמשקף דיכוי שעתוק כמעט אוניברסלי בהשוואה של רירית הרקטום ב-IBS-C. כל 17 הגנים הממומנים כמטרות היו בין הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי (חפיפה נצפית של 17/17, 100%). בהינתן שיעור ביטוי דיפרנציאלי של 94.5% ברקע, החפיפה הצפויה עבור כל קבוצה אקראית של 17 גנים היא 16.1 גנים. מבחן פישר המדויק הניב p = 0.384 עם יחס סיכויים מתוקן לרציפות של 2.03 (רווח ברך 95% של 0.12–33.73), תוצאה שלא הייתה מובהקת סטטיסטית ב-α = 0.05 (איור 3A–C).

תוצאה זו מעידה כי החפיפה הנצפית של 17/17 אינה עולה על החפיפה הצפויה במקרה תחת פרופיל הביטוי הגנומי הרחב של מערך נתונים זה. בהתאם לכך, ממצאים אלה מפורשים כדפוס כיווני תיאורי, שבו כל 17 המטרות החזויות היו בעלות ביטוי מופחת (downregulated) באופן עקבי ומשמעותי ברקמת רירית של רקטום בחולי IBS-C, ולא כראיה להעשרה סטטיסטית או תיקוף עצמאי על רקע גנומי. בדיקת העשרה פורמלית תדרוש שחזור במערכי נתונים טרנסקריפטומיים עם פרופילי ביטוי דיפרנציאלי סלקטיביים יותר, שבהם הרבה פחות ממחצית מכל הגנים יגיעו למשמעות סטטיסטית. יש להדגיש כי הירידה האחידה בביטוי של כל 17 הגנים החופפים היא תצפית תיאורית ולא תוצאה סטטיסטית שתוקפה בנפרד, מכיוון שהרקע של הביטוי הדיפרנציאלי במערך נתונים זה הוא בעצמו בעיקר עם ביטוי מופחת; כיוון ירידה משותף בקרב הגנים החופפים הוא צפוי ולא הוכפף לבדיקת כיווניות פורמלית. לפיכך, כיוון אחיד זה לא צריך להיחשב כראיה סטטיסטית עצמאית לוויסות מתואם וספציפי למטבוליטים.

דפוסים ספציפיים למטבוליטים

לפרופיFunnyonato היה מספר הגבוה ביותר של גנים חופפים, כולל CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN ו-TBXA2R, מה שמרמז על מעורבות אפשרית של סיגנלינג המגיב לחומצות שומן קצרות שרשרת וסיגנלינג הקשור ל-Gq. בוטיראט חפף ל-HDAC3, דבר העולה בקנה אחד עם הביולוגיה של היסטון דה-אצטילאז הקשורה לבוטיראט, אם כי הורדה של רמות ה-mRNA לבדה אינה מוכיחה תגובתיות משתנה לבוטיראט. חפיפות הקשורות לחומצות מרה כללו את הרצפטורים הגרעיניים VDR ו-NR1H4, שניהם אפקטורים מוכרים של סיגנלינג חומצות מראה במעי^38,39. טריפטמין חפף ל-HTR1B, HTR2A, HTR2B ו-HTR6, מה שמעיד על סיגנלינג סרוטונירגי כמודול מועמד, מערכת עם תפקידים מבוססים בניידות וב הפרשה של מערכת העיכול⁴⁰. חומצה אינדול-3-לקטית וחומצה אינדול-3-פרופיונית חפפו ל-KYAT1, ואורוליתין A חפף ל-CASP3.

העשרה של מסלולים

ניתוח העשרה תפקודי של 17 הגנים החופפים זיהה מסלולים הקשורים לאיתות במורד של קולטנים המצומדים לחלבון G (GPCR), איתות Gαq, קישור ליגנדים ל-GPCR, סינפסה סרוטונינרגית, אינטראקציה בין ליגנדים נוירו-אקטיביים לרצפטורים, העברת אותות סידן, איתות cAMP והפרשת הורמונים פפטידיים. תוצאות אלו עקביות עם הרכבו של סט הגנים ותומכות בלכידות הביולוגית שלו, אך הן משקפות את האנוטציה התפקודית של הגנים שהוגשו ולא ראיות עצמאיות לפעילות ברמת המסלול.

מבנה רשת אינטראקציות חלבון-חלבון

בניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון וניתוח העשרה של מסלולים פוענחו באמצעות שלוש רשתות משלימות. במטא-רשת המשולבת של 17 גנים (רשת 1), המבנה הבולט ביותר הנתמך על ידי אנוטציות היה רכיב איתות GPCR/Gαq הממוקד ב-GNAQ, אשר קישר בין GNAQ לגנים הקשורים לקולטנים, כולל TBXA2R, CASR, HTR2A ו-HTR2B. קישוריות מוגבלת של קולטני סרוטונין נשמרה גם היא, ובמיוחד בין HTR2A ל-HTR2B, בעוד שמספר גנים אחרים נותרו מבודדים או מחוברים באופן חלש בסף הביטחון שנבחר. הרשת הספציפית לפרופיונת (רשת 2) הראתה טופולוגיה מוגבלת יותר, כאשר GNAQ שמר על קשרים הנתמכים על ידי אנוטציות ל-CASR ו-TBXA2R, בעוד ש-FFAR2, GPR68, GCG, GPHN ו-MLN היו מבודדים או מחוברים באופן חלש. רשת הטריפטמין/סרוטונין (רשת 3) כללה את HTR1B, HTR2A, HTR2B ו-HTR6; בתוך תת-קבוצה זו, HTR2A ו-HTR2B הראו את החיבור העיקרי הנתמך על ידי אנוטציות, בעוד ש-HTR1B ו-HTR6 לא היו מחוברים באופן ישיר בסף שנבחר (איור 4A–C).

עגינה מולקולרית (Molecular docking)

ביצוע עגינה מולקולרית (Molecular docking) בוצע על חמישה קומפלקסים נבחרים של מטבוליט-חלבון. זוגות חומצה מרה-קולטן גרעיני הראו ציוני Vina חיוביים יותר מאשר urolithin A-CASP3 ו-tryptamine-HTR2A. ל-LCA-VDR היה הציון הגבוה ביותר, −10.0 kcal/mol, ואחריו LCA-NR1H4/FXR (−9.9 kcal/mol) ו-UDCA-NR1H4/FXR (−9.4 kcal/mol). ל-urolithin A-CASP3 ול-tryptamine-HTR2A היו ציונים נמוכים יותר אך עדיין סבירים של −7.1 kcal/mol (טבלה 2).

עבור קומפלקס LCA-VDR (מזהה PDB: 1DB1), התבסס הפוזה החזויה על קשר מימן קונבנציונלי בין חמצן הקרבוקסילאט של LCA לבין Ser278 (4.29 Å), יחד עם מגעים הידרופוביים נרחבים הכוללים את Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, ו-His397, ומגעים נוספים מסוג van der Waals עם Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, ו-Phe150. לפוזה המדורגת ראשונה היה ציון Vina של −10.0 kcal/mol, גודל חלל של 2055 ų, ומרכז רשת של (10, 19, 33) (טבלה 3, איור 5A,B).

עבור קומפלקס ה-LCA-NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT), ציון העגינה של −9.9 kcal/mol לווה בקשרי מימן חזויים המערבים את His294 ו-Ile335, אינטראקציית π-Sigma עם His294, ומגעים הידרופוביים מסוג Alkyl או π-Alkyl המערבים את Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352 ו-His447, כאשר מגעים נוספים מסוג van der Waals תמכו בהתאCמה של השלד הסטרואידי בכיס ה-FXR (טבלה 4, דמות 6A,B).

התבניות החזויות של קומפלקס UDCA-NR1H4/FXR ‏(PDB ID: 3DCT) הראו קשר מימן קונבנציונלי עם His447 (3.66 Å), קשר מימן נוסף עם Gly322 (3.46 Å), אינטראקציית π-Anion עם Val325 (4.96 Å), וקשר פחמן-מימן עם Trp469 (4.51 Å). מפת האינטראקציות זיהתה גם מגעים לא מועדפים מסוג donor-donor עם Arg395 (3.89 Å) ו-Gln396 (3.40 Å), דבר המרמז כי ציון ה-Vina הנמוך יותר של UDCA בהשוואה ל-LCA באותו כיס קולטן עשוי לנבוע מגיאומטריה מקומית או אלקטרוסטטיקה פחות מועדפות (Table 5, Figure 7A,B).

בקומפלקס urolithin A-CASP3 (מזהה PDB: 2DKO), מצב הקישור החזוי כלל קשרי מימן קונבנציונליים עם Gln161 (3.78 ו-4.19 Å), Ser120 (3.95 Å), ו-Arg207 (3.05 ו-3.77 Å), והיה מיוצב בנוסף על ידי אינטראקציות π-Cation עם Arg207, קשר מימן מסוג π-Donor עם Cys163, ומגעים נוספים מסוג π-Alkyl ו-van der Waals המערבים את Arg64, Ala162, His121, Ser205, ו-Trp206 (טבלה 6, איור 8A,B).

עבור קומפלקס tryptamine-HTR2A (מזהה PDB: 6A93), הפוזה החזויה התייצבה על ידי גשר מלח אלקטרוסטטי בין האמין הפרוטוני של tryptamine לבין Asp155, האספרטט השמור בסליל הת sublemembrane 3 (D3.32 לפי מספור Ballesteros-Weinstein) המעגן את האמין הפרוטוני של ליגנדים אימינרגיים ברחבי רצפטורים של סרוטונין ורצפטורים קשוריים^41,42,43, יחד עם קשרי מימן עם Thr160 ו-Ser159, מגעים ארומטיים עם Phe340 ו-Trp336, ואינטראקציות π-Alkyl עם Val156 ו-Ile163. מגעים נוספים מסוג van der Waals עם Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332 ו-Leu123 תמכו בתבנית קישור לכיס אורתוסטרי (טבלה 7, איור 9A,B).

תיקוף פרוטוקול עגינה (Docking)

כדי להעריך את מהימנות פרוטוקול העגינה (docking), בוצעו שני ניסויי בקרה משלימים. עבור בקרות עגינה חוזרת (positive controls), ליגנדים שגובשו יחד עם החלבון (co-crystallized ligands) הופקו ממבני ה-X-ray הייחוס שלהם ועוגנו מחדש לאתרי הקשירה הטבעיים שלהם. התנוחה (pose) החזויה בעלת הדירוג הגבוה ביותר עבור אנלוג הוויטמין D שנקרא VDX ב-VDR/1DB1 סטתה ב-0.87 Å מהמיקום הקריסטלוגרפי, والليגנד שגובש יחד עם החלבון WAY-362450 ב-FXR/3DCT סטה ב-1.79 Å; שני הערכים היו נמוכים מסף הקבלה המקובל של 2.0 Å, מה שמסמך את התקפות הגאומטרית של פרוטוקול העגינה עבור מערכות רספטורים אלו (איור 10A,B). עבור בקרות עגינה צולבת (negative controls), חומצה ליטוכולית עוגנה אל caspase-3 (2DKO), פרוטאוז סיסטאין שאינה ליגנד ידוע עבורו, מה שהניב ציון חזוי (−8.3 kcal/mol) חלש ב-1.7 kcal/mol מאשר ביעד ההומולוגי שלה, VDR (−10.0 kcal/mol), ממצא העולה בקנה אחד עם הסלקטיביות החזויה לאתר הקשירה. עגינה של Tryptamine אל VDR הניבה ציון חזוי של −6.4 kcal/mol בהשוואה ל-−7.1 kcal/mol ביעד ההומולוגי HTR2A; הפרש של 0.7 kcal/mol שנמצא בתוך טווח האי-ודאות המדווח של ציוני עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה, ולכן מעיד על סלקטיביות חזויה מתונה בלבד עבור ליגנד קטן זה (איור 10C). יחד, בקרות אלו מעידות כי פרוטוקול העגינה משחזר גאומטריות קשירה ידועות ומבדיל בין זוגות הומולוגיים ללא-הומולוגיים תחת התנאים שנבדקו, בעוד שהן נותרות תחזיות חישוביות שאינן מחליפות מדידות זיקה (affinity) ניסיוניות (טבלה 8).

סימולציית דינמיקה מולקולרית

סימולציות של דינמיקה מולקולרית בוצעו עבור חמשת הקומפלקסים בעדיפות גבוהה לאורך מסלולי ייצור של 200 ns. ארבעת הקומפלקסים של הקולטנים המסיסים והגרעיניים סומולצו בממס מימי מפורש, בעוד שקומפלקס tryptamine-HTR2A סומולץ בשכבת ליפידים מפורשת של POPC כדי לספק סביבת ממברנה הולמת פיזיולוגית עבור קולטן זה המצומד לחלבון G. ניתוחים בדקו את היציבות הדינמית של התנוחות שעגנו תחת תנאים תלויי-זמן ואפשרו השוואה של התנהגות מבנית יחסית בין הקומפלקסים (טבלה 9).

פרופיל ה-RMSD של קומפלקס LCA-VDR/1DB1 הראה תקופת שיווי משקל קצרה במהלך 10 ns הראשונים, שלאחריה הופיעה רמה יציבה (plateau), עם תנודות בעיקר בטווח של 0.20–0.28 nm (איור 11A). ערכי ה-RMSF היו נמוכים, ותנודות השלד (backbone) היו < 0.15 nm עבור רוב השאריות (איור 11B). ניתוח קשרי מימן הראה רשת עקבית של 2–5 קשרי מימן, עם עליות מזדמנות עד ל-7 (איור 11C). רדיוס הגירציה (Rg) נשמר בטווח של 1.25–1.75 nm, ושטח הפנים החשוף לממס (SASA) נשמר סביב 130 nm² (איור 11D,E).

קומפלקס ה-urolithin A-CASP3/2DKO הפגין פעילות דינמית רבה יותר. ה-RMSD עלה בתחילה ולאחר מכן תנוד בין 0.4 ל-0.7 nm, עם אירוע קצר של סטייה גבוהה סביב 165 ns (איור 12A). ניתוח RMSF הראה ניידות גבוהה ברמת השארית, כאשר התנודות הגדולות ביותר נצפו באזור הלולאה הגמישה סביב שארית 175 (איור 12B). ניתוח קשרי מימן חשף רשת ראשונית נרחבת של כ-2–5 קשרים ב-30–40 ns הראשונים, ולאחריהם בעיקר 0 עד 2 קשרים לסירוגין (איור 12C). פרופילי רדיוס הג'ירוציה (radius-of-gyration) וה-SASA המתאימים מוצגים ב-איור 12D,E.

עבור מערכות חומצות המרה של NR1H4/FXR (3DCT), פרופיל ה-RMSD של השלד נשאר בטווח צר יחסית לאורך רוב המסלול (איור 13A), בעוד שפרופיל ה-RMSF הראה ניידות נמוכה יותר באזורי הליבה ותנודתיות גבוהה יותר באזורים גמישים (איור 13B). קומפלקס LCA-3DCT שמר על כשלושה עד ארבעה קשרי מימן עקביים לאורך המסלול, בעוד שקומפלקס UDCA-3DCT הפגין תנודתיות רבה יותר בקשרי המימן והפחתה במספרם לאחר כ-125 ns. פרופילי רדיוס הגירציה (Radius-of-gyration) עבור המערכות הקשורות ל-LCA ו-UDCA מוצגים ב-איור 13C,D, בהתאמה, ופרופילי ה-SASA המתאימים מוצגים ב-איור 13E,F.

דינמיקה מולקולרית של ממברנה עבור קומפלקס tryptamine-HTR2A

קומפלקס ה-tryptamine-HTR2A/6A93 סומלה למשך 200 ns בתוך שכבה דו-שפתית מפורשת של שומני POPC הכוללת 258 מולקולות שומן, מודל מים מפורש בעל שלושה אתרים, ו-0.15 M NaCl, לגודל מערכת כולל של כ-100,925 אטומים^33,44,45. הרצפטור נשאר מוטמע באופן יציב בשכבהKthroughout throughout throughout the trajectory (איור 14). ה-RMSD של השלד עלה מכ-0.10 nm למישור יציב סביב 0.15–0.20 nm במהלך 100 ns הראשונים ונשאר יציב לאחר מכן, כאשר כל הערכים היו מתחת ל-0.25 nm, דבר המעיד על כך שהרצפטור שמר על קונפורמציה יציבה בסביבת הממברנה ללא פריסה גלובלית (איור 15A). ה-RMSF לכל שארית הראה תנודות נמוכות בליבה הספירלית חוצת-הממברנה עם ניידות גבוהה יותר כמצופה באזורי הלולאות ובקצוות, בהתאמה לגמישות טיפוסית של GPCR (איור 15B). רדיוס הג'ירציה היה מוגבל היטב בין כ-2.06 ל-2.12 nm, וה-SASA תמרמר בתוך טווח צר ללא סחיפה הדרגתית, שניהם מאשרים את השמירה על צרור חלבוני חוצה-ממברנה דחוס (איור 15C,D).

קשרי מימן בין החלבון לליגנד נשמרו לאורך כל המסלול (איור 15E), כאשר נרשמו תנודות משמעותיות במספר קשרי המימן, שנעו בין 1 ל-3. כדי להעריך באופן ספציפי את העמידות של האינטראקציה היונית המרכזית, נוטרר לאורך כל המסלול המרחק המינימלי בין חנקן האמוניום הפרוטוני של הטריפטאמין לבין אטומי החמצן של הקרבוקסילאט ב-Asp155 (D3.32). מרחק זה נשאר מרוכז סביב ממוצע של 0.270 nm (מינימום 0.424 nm, מקסימום 0.247 nm), ומגע גשר המלח (< 0.4 nm) נשמר ב-99.9% מזמן הסימולציה עם שתי סטיות חולפות וקצרות בלבד, ללא אירוע התנתקות ממושך (איור 16). תוצאות אלו מרמזות כי האינטראקציה היונית השמורה של Asp155 הייתה מספיקה כדי לייצב את הטריפטאמין בתוך הכיס האורתוסטרי של HTR2A לאורך סימולציית הממברנה.

אנרגיית קישור חופשית בשיטת MM-PBSA ופירוק לפי שאריות

ניתוח MM-PBSA בוצע כדי להוסיף שכבת תיעדוף אנרגטית נוספת לחמשת הקומפלקסים (Table 10). עבור ארבעת הקומפלקסים המימיים, פירוק לפי שאריד (per-residue decomposition) זיהה את התורמים האנרגטיים העיקריים עבור כל מצב קישור שנחזה. בקומפלקס LCA-VDR/1DB1, לליגנד ול-Gln317 הייתה תרומה חיובית, בעוד ש-Trp286 הראה תרומה שלילית. בקומפלקס urolithin A-CASP3/2DKO, השארידים Arg64 ו-Arg207 הראו תרומות שליליות חזקות ברמת השאריד, מה שמעיד על ייצוב פולרי או אלקטרוסטטי משמעותי; עם זאת, המסלול (trajectory) התואם נותר דינמי מאוד, מה שמוכיח כי אנרגטיקה חיובית ברמת השאריד לבדה אינה מבטיחה יציבות מתמשכת של הקומפלקס. עבור מערכות 3DCT, הקישור של LCA הונע בעיקר על ידי Arg331, בעוד שהקישור של UDCA כלל רשת אנרגטית מפוזרת יותר הכוללת את Glu326, Asp394, Arg395, Arg441 ו-Asp470. בארבע המערכות המימיות, פירוק ה-MM-PBSA תמך בתיעדוף היחסי של הקומפלקסים המבוססים על LCA.

עבור קומפלקס ה-tryptamine-HTR2A/6A93 המוטמע בממברנה, בוצע ניתוח MM-PBSA על תת-המערכת של החלבון והליגנד שהוצאה ממסלול השכבה הכפולה (bilayer trajectory)^46,47. נצפו תרומות חיוביות עבור הליגנד ו-Asp155 (D3.32), שהיה התורם המייצב הדומיננטי ביותר ברמת השאריות, בדומה לאינטראקציית גשר המלח שזוהתה הן בניתוחי העגינה (docking) והן בניתוחי המרחקים של המסלול. Trp137 הראה את התרומה השלילית הגדולה ביותר לכל שארית מבין השאריות של כיס האורתוסטרי הסובבות (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171), אשר יחד מרכיבות את רשת המגעים הארומטיים והפולריים המצפה את כיס הקשירה. ערכים אלו מייצגים הערכות חישוביות יחסיות לצורך תיעדוף מבני ואינם מהווים זיקות קשירה ניסיוניות.

איור 1: זרימת עבודה חישובית לתיעודו של גן מאחס הקשור למטבוליטים ב-IBS-C. ייצוג סכמטי של זרימת עבודה בת שמונה שלבים המשלבת בחירת מטבוליטים, חיזוי מטרות, ביטוי דיפרנציאלי טרנסקריפטומי, ניתוח חפיפה, העשרה של רשתות ומסלולים, עגינה מולקולרית, סימולציית דינמיקה מולקולרית וניתוח אנרגיה חופשית של קישור בשיטת MM-PBSA. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וחפיפת מטרות-מטבוליטים ברירית של IBS-C. (A) תרשים געש של ביטוי דיפרנציאלי ברמת הגן ב-GSE36701. נקודות כחולות, גנים עם ביטוי מופחת באופן מובהק; נקודות אדומות, גנים עם ביטוי מוגבר באופן מובהק; נקודות אפורות, גנים שאינם מובהקים. גנים נבחרים הקשורים למטבוליטים וחופפים מסומנים. (B) דיאגרמת ון המראה את החפיפה בין 330 מטרות מטבוליטים ייחודיות שנחזו לבין גנים עם ביטוי מופחת ב-GSE36701; 17 גנים היו משותפים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

איור 3: הערכה סטטיסטית של 17 הגנים מטרת המטבוליטים שנחזו אל מול GSE36701. (A) log2 fold change לכל גן עבור כל 17 הגנים, צבוע לפי רמת מובהקות. (B) שיעור ביטוי דיפרנציאלי של גני רקע לעומת המטרות שנחזו, באמצעות מבחן Fisher המדויק. (C) טבלת התניה (contingency table) של שתיים על שתיים משמשת למבחן Fisher המדויק. כל 17 המטרות הראו ביטוי מופחת (downregulated) באופן מובהק; החפיפה מפורשת כדפוס כיווני תיאורי ולא כהעשרה סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: בניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון מורכבת והעשרת מסלולים של רשתות אינטראקציות חלבון-חלבון של גנים חופפים הקשורים למטבוליטים. (A) רשת 1: מטה-רשת משולבת של כל 17 הגנים. (B) רשת 2: רשת ספציפית לפרופיFunnyonate של שמונה גנים (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R). (C) רשת 3: רשת טריפטאמין/סרוטונין של ארבעה גנים (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6). הרשתות הופקו עבור Homo sapiens לכל הפחות, תוך שימוש בבניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרת מסלולים ברמת ביטחון של 0.700 ≥. קצוות מייצגים קשר תפקודי נתמך על ידי אנוטציה אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מורחבת של איור זה.

איור 5: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של חומצה ליטוכולית בקומפלקס עם VDR (PDB ID: 1DB1). (A) ייצוג פני שטח וסרטון תלת-ממדי כאשר חומצה ליטוכולית מוצגת ככדורים. (B) מפת אינטראקציה דו-ממדית המראה את קשר המימן של Ser278 ואת מגעיהי ההידרופוביים ומגעיהי של ואן דר ואלססביב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6. ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של חומצה ליתוכולית בקומפלקס עם NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (A) ייצוג תלת-ממדי של פני השטח ומודל קרטון. (B) מפת אינטראקציות דו-ממדית המראה קשרי מימן עם His294 ו-Ile335, אינטראקציית π-Sigma ומגעים סביבתיים. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

איור 7: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של חומצה אורסודאוקסיכולית בקומפלקס עם NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (A) ייצוג תלת-ממדי של פני השטח ובמבנה סרטון (cartoon). (B) מפת אינטראקציות דו-ממדית המראה קשרי מימן עם His447 ו-Gly322, אינטראקציית π-Anion עם Val325, קשר פחמן-מימן עם Trp469, ומגעים לא רצויים מסוג תורם-תורם עם Arg395 ו-Gln396. אנא לחצו כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.

איור 8: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של urolithin A במתחם עם CASP3 (מזהה PDB: 2DKO). (A) ייצוג שטח וסרטון (cartoon) תלת-ממדי. (B) מפת אינטראקציה דו-ממדית המראה קשרי מימן עם Gln161, Ser120 ו-Arg207, אינטראקציות π-Cation עם Arg207, קשר מימן π-Donor עם Cys163, ומגעים סביבתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של tryptamine בקומפלקס עם HTR2A (PDB ID: 6A93). (A) ייצוג פני שטח וסרט (cartoon) תלת-ממדי שנוצר בתוכנה לוויזואליזציה מולקולרית תלת-ממדית. (B) מפת אינטראקציות דו-ממדית שנוצרה בכלי לוויזואליזציה מולקולרית ובכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, הממחישה את גשר המלח של Asp155 ואינטראקציות נוספות באתר הקשירה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: תיקוף פרוטוקול העגינה. (A,B) עגינה מחדש (Redocking) של ליגנדים שגובשו יחד עם VDR/1DB1 (RMSD 0.87 Å) ו-FXR/3DCT (RMSD 1.79 Å); התנוחות הקריסטלוגרפיות והתנוחות לאחר העגינה מחדש מוצגות בחפיפה, ושניהם נמוכים מסף הקבלה של 2.0 Å. (C) סלקטיביות בעגינה צולבת (Cross-docking): ציוני Vina של ליגנדים תואמים מול ליגנדים שאינם תואמים עבור חומצה ליתוכולית וטריפטאמין. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11. ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של קומפלקס LCA-VDR/1DB1 לאורך 200 ns. (A) פרופיל RMSD. (B) פרופיל RMSF. (C) מספר קשרי מימן. (D) פרופיל רדיוס גיration. (E) פרופיל SASA. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של קומפלקס urolithin A-CASP3/2DKO לאורך 200 ns. (A) פרופיל RMSD המראה תנודות קונפורמציוניות רחבות ואירוע סטייה גבוהה חולף סביב 165 ns. (B) פרופיל RMSF המראה גמישות בולטת ברמת השארית סביב שארית 175. (C) ספירת קשרי מימן. (D) פרופיל רדיוס גירציה. (E) פרופיל SASA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של מערכות חומצות מרה NR1H4/FXR (3DCT) לאורך 200 ns. (A) פרופיל RMSD של השלד לקומפלקס 3DCT. (B) פרופיל RMSF של השלד. (C) פרופיל רדיוס גירציה עבור 3DCT-LCA. (D) פרופיל רדיוס גירציה עבור 3DCT-UDCA. (E) פרופיל SASA עבור 3DCT-LCA. (F) פרופיל SASA עבור 3DCT-UDCA. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 14: קומפלקס tryptamine-HTR2A מוטמע בשכבה כפולה מפורשת של ליפידי POPC. הקולטן מוצג כסרט (cartoon) החוצה את השכבה הכפולה, ליפידי POPC מוצגים כקווים עם הדגשה של קבוצות הראש הפוספט, וטריפטמין נמצא בתוך התבנית האורתוסטרית. מים מוצגים מעל ומתחת לממברנה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 15: ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של קומפלקס tryptamine-HTR2A/6A93 לאורך 200 ns בשכבה ליפידית מפורשת של POPC. (A) פרופיל RMSD של השלד (Backbone). (B) פרופיל RMSF לכל שארית. (C) פרופיל רדיוס גירציה. (D) פרופיל SASA. (E) מספר קשרי המימן בין החלבון לליגנד. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 16: עקביות האינטראקציה היונית בין tryptamine ל-Asp155 (D3.32) לאורך מסלול ממברנה של 200 ns. המרחק המינימלי בין חנקן האמוניום של ה-tryptamine לבין אטומי החמצן של הקרבוקסילאט ב-Asp155 מוצג כנגד הזמן; הקו המקווקו מסמן את סף המגע של גשר המלח ב-0.4 nm. המגע נשמר לאורך 99.9% מהסימולציה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סמל גן	מטבוליט(ים) מקור	קטגוריה פונקציונלית	log2FC	FDR (ערך P מתוקנן)	רמת חשיבות
GCG	פרופיאונט	חלבון הקשור להורמון פפטידי	−1.342	1.97e−7	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001 & |logFC > 1
HDAC3	בוטיראט	אנזים	−1.234	2.44e−6	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	אורולית'ין A	אנזים	−1.198	6.66e−7	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	פרופיאונט	קולטן ממברנה	−1.137	4.35e−6	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	פרופיონאט	חלבון העברה של אותים תוך-תאי	−1.122	1.05e−6	FDR (שיעור התגליות המוטעות) <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	פרופיונאט	חלבון תוך-תאי אחר	−1.109	1.13e−6	שיעור התגליות השגויות (FDR) <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	פרופיואט	קולטן קרומי	−1.104	4.04e−7	FDR (שיעור התשריות המוטעות) <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	טריפטאמין	קולטן ממברנתי	−0.967	2.17e−5	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001
VDR	חומצה ליטוכולית	קולטן גרעיני	−0.942	5.73e−7	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001
HTR2A	טריפטאמין	קולטן קרומי	−0.937	4.99e−6	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001
FFAR2	פרופיאונט	קולטן קרומי	−0.889	1.44e−4	FDR (שיעור התשובה המדומה) <0.001
NR1H4	חומצה ליתוכולית / חומצה אורסודאוקסיכולית	קולטן גרעיני	−0.861	3.68e−6	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001
HTR2B	טריפטאמין	קולטן קרומי	−0.702	1.29e−4	FDR (שיעור התשרירים השגויים) <0.001
MLN	פרופינאט	חלבון הקשור להורמון פפטידי	−0.605	7.39e−5	שיעור הגילויים השגויים (FDR) <0.001
KYAT1	חומצה אינדול-3-לקטית / חומצה אינדול-3-פרופיונית	אנזים	−0.530	3.61e−4	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001
CASR	פרופיאונט	קולטן קרומי	−0.483	4.05e−4	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.001
HTR1B	טריפטאמין	קולטן קרומי	−0.455	3.18e−2	FDR (שיעור התגליות השגויות) <0.05

טבלה 1: גנים מטרה חזויים הקשורים למטבוליטים החופפים לגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במערך הנתונים של רירית הרקטום ב-IBS-C. כל הגנים החופפים המפורטים היו בעלי ביטוי מופחת (downregulated). טבלה 1 הוגשה בנפרד כטבלת גיליון אלקטרוני ומפרטת, עבור כל מטרה, את המטבוליט(ים) ממנו נגזר, קטגוריה תפקודית, מקור חיזוי המטרה (חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון, תוכנית עגינה מולקולרית (molecular docking), או שניהם), ציון אינטראקציה משולב של חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון, וההסתברות של תוכנית העגינה המולקולרית, ובמידת הזמינה, את דרגת החיזוי, log2 fold change, ו-FDR עם דרגת מובהיות הביטוי. מקור: ערכי ביטוי הגנים התקבלו מטבלת הביטוי הדיפרנציאלי GSE36701 המקובצת לפי גנים (הגשוש בעל ה-FDR הנמוך ביותר לכל גן). מקור חיזוי המטרה וערכי הביטחון נאספו מפלט של חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון ותוכנית עגינה מולקולרית, תוך שימוש בסף של ציון אינטראקציה משולב של חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון ≥ 0.700 והסתברות של תוכנית עגינה מולקולרית ≥ 0.70. ציוני חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון הם ציונים משולבים בסולם של 0–1; STP מציין הסתברות של תוכנית עגינה מולקולרית. Tier 1 = תמיכה קפדנית של חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון; Tier 1+ = תמיכה קפדנית של חיזוי מטרה של אינטראקציה כימית-חלבון הנתמכת באופן הצלבי על ידי תוכנית עגינה מולקולרית.

קומפלקס	חלבון (PDB ID)	ליגנד	ציון Vina (kcal/mol)	גודל חלל (A^3)	מרכז רשת X,Y,Z (A)	תיבת חיפוש (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	חומצה ליתוכולית	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	חומצה ליתוכולית	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	חומצה אורסודאוקסיכולית	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
Urolithin A-CASP3	CASP3 (2DKO)	Urolithin A	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
Tryptamine-HTR2A	HTR2A (6A93)	טריפטאמין	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

טבלה 2: תוצאות עגינה מולקולרית: דירוגים מובילים של עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה ופרמטרי חלל עבור חמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד בעדיפות גבוהה. גודל החלל מדווח ב-ų. מקור: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx, גיליון 'Original_Docking_Scores'. עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה; exhaustiveness = 8, seed = 42 (קבוע), num_modes = 9 עבור כל הקומפלקסים; תדווח תנוחה בדירוג הגבוה ביותר (mode 1).

סוג האינטראקציה	שאריות	מרחק (A)	הערות
קשר מימן קונבנציונלי	Ser278	4.29	חמצן הקרבוקסילאט של LCA
מגע הידרופובי / Pi-Alkyl	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
מגע ואן דר ואלס	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

טבלה 3: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של חומצה ליתוכולית עם VDR (מזהה PDB: 1DB1). מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשאריות, כפי שדווח בתוצאות כתב היד (עגינה מולקולרית). '-' מציין שערך מרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

סוג האינטראקציה	שאריות (Residues)	מרחק (A)	הערות
קשר מימן	His294	-
קשר מימן	Ile335	-
אינטראקציית Pi-Sigma	His294	-
Alkyl / Pi-Alkyl (הידרופובית)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
מגע Van der Waals	שאריות נוספות בתעלה (לא צוינו בנפרד במקור)	-	תומך בהתאכסנות של השלד הסטרואידי

טבלה 4: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של חומצה ליתוכולית עם NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT).

מקור: כלי לוויזואליזציה מולקולרית וליצירת דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות של ליגנד-שארית, כפי שדווח במדור תוצאות בכתב היד ( docking מולקולרי). '-' מציין שערך מרחק לא דווח בנפרד עבור מגע זה.

סוג אינטראקציה	שאריל(ים)	מרחק (A)	הערות
קשר מימן קונבנציונלי	His447	3.66
קשר מימן	Gly322	3.46
אינטראקציית Pi-Anion	Val325	4.96
קשר פחמן-מימן	Trp469	4.51
מגע תור-תור לא מועדף	Arg395	3.89
מגע תור-תור לא מועדף	Gln396	3.40

טבלה 5: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של חומצה אורסודאוקסיכולית עם NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT).מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשאריות, כפי שדווח בתוצאות כתב היד (עגינה מולקולרית). '-' מעיד על כך שערך מרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

סוג אינטראקציה	שאריות (Residues)	מרחק (A)	הערות
קשר מימן קונבנציונלי	Gln161	3.78
קשר מימן קונבנציונלי	Gln161	4.19	מגע שני
קשר מימן קונבנציונלי	Ser120	3.95
קשר מימן קונבנציונלי	Arg207	3.05
קשר מימן קונבנציונלי	Arg207	3.77	מגע שני
אינטראקציית Pi-Cation	Arg207	-
קשר מימן Pi-Donor	Cys163	-
מגע Pi-Alkyl / van der Waals	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

טבלה 6: מצבי קישור שהופקו עבור עגינה (docking) של urolithin A עם CASP3 (PDB ID: 2DKO). מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשארית, כפי שדווח בתוצאות כתב היד (Molecular docking). '-' מציין כי ערך מרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

סוג האינטראקציה	שאריש(ים)	מרחק (A)	הערות
גשר מלח אלקטרוסטטי	Asp155 (D3.32)	-	אמין פרוטוני של tryptamine
קשר מימן	Thr160	-
קשר מימן	Ser159	-
מגע ארומטי	Phe340, Trp336	-
אינטראקציית Pi-Alkyl	Val156, Ile163	-
מגע ואן דר ואלס	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

טבלה 7: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של tryptamine עם HTR2A (PDB ID: 6A93). מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לתרשימי אינטראקציה דו-ממדיים, תרשימי אינטראקציית ליגנד-שאריד דו-ממדיים, כפי שדווח בסעיף תוצאות (Molecular docking) בכתב היד. '-' מציין כי לא דווח ערך מרחק בנפרד עבור מגע זה.

(A) תיקוף באמצעות Redocking (ביקורות חיוביות)
מזהה PDB	חלבון	ליגנד של קריסטל משותף	ציון Vina (kcal/mol)	RMSD (A)	סף (A)	תוצאה
1DB1	VDR	VDX (אנלוג של ויטמין D)	−13.0	0.87	2.0	עבר
3DCT	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	עבר
(B) תיקוף באמצעות Cross-docking (ביקורות שליליות)
ליגנד	מטרה תואמת (PDB)	ציון תואם (kcal/mol)	מטרה לא תואמת (PDB)	ציון לא תואם (kcal/mol)	דלתא (kcal/mol)	סלקטיביות
חומצה ליתוכולית	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	מאושרת
טריפטאמין	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	צנועה (במסגרת אי-הוודאות של Vina +/−0.5–1.0)

טבלה 8: תוצאות תיקוף של פרוטוקול העגינה (docking): ערכי RMSD של עיגון מחדש (ביקורות חיוביות) ומדדי עיגון צולב (ביקורות שליליות).מקור: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx ו-Docking_Validation/Logs/*.log (עיגון מולקולרי של ליגנדים מטבוליטים לחלבונים מטרה, exhaustiveness = 8, seed = 42, תיבה בגודל 25 Å × 25 Å × 25 Å). RMSD חושב על ידי התאמת שמות אטומים של אטומים כבדים (ללא סופרפוזיציה).

קומפלקס	RMSD (nm), ממוצע + / – SD (טווח)	Rg (nm), ממוצע + / – SD (טווח)	SASA (nm^2), ממוצע + / – SD (טווח)	קשרי מימן, ממוצע + / – SD (טווח)	RMSF (nm), ממוצע (מקסימום)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (מקסימום 0.600 בשארית 120)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (מקסימום 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (מקסימום 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (מקסימום 2.532 בשארית 175)
Tryptamine-HTR2A/6A93 (ממברנה)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (מקסימום 0.319)

טבלה 9: סיכום התנהגות סימולציית דינמיקה מולקולרית של 200 ns עבור חמשת קומפלקסי הפרוטאין-ליגנד בעדיפות גבוהה, כולל מערכת tryptamine-HTR2A המוטמעת בממברנה.מקור: קובצי כלי ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית (.xvg) — gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf — שחושבו על פני 150 ns האחרונים (50–200 ns) של כל הרצת ייצור של 200 ns, לפי שלב 8.8 בפרוטוקול. RMSD/Rg הותאמו לשלד הפרוטאין; רדיוס גשוש SASA הוא 0.14 nm; סף תורם-מקבל של קשרי H-bond הוא 0.35 nm / 30 °. LCA-3DCT ו-UDCA-3DCT חולקים מסלול שלד פרוטאין אחד (RMSD, RMSF) עם Rg/SASA/H-bonds ספציפיים לליגנד.

Tryptamine-HTR2A/6A93 (ממברנה) — פירוק כמותי לכל שארית
שארית	תרומת ddG כוללת (kcal/mol), ממוצע + / − SD	כיוון
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	מייצב (דומיננטי)
Tryptamine (ליגנד)	−13.01 + / − 6.22	מייצב
Tyr171	13.62 + / − 4.54	מערער
Val167	23.32 + / − 3.96	מערער
Val156	20.03 + / − 3.81	מערער
Thr160	4.86 + / − 3.64	מערער
Ser159	24.16 + / − 3.48	מערער
Ser86	24.48 + / − 3.65	מערער
Phe87	35.18 + / − 4.04	מערער
Phe133	32.80 + / −3.70	מערער
Phe140	30.63 + / − 3.84	מערער
Phe141	35.25 + / − 3.55	מערער
Ile163	27.64 + / − 3.71	מערער
Trp137	53.77 + / − 4.32	מערער (הבלתי גמיש הגדול ביותר)
ארבעת הקומפלקסים האחרים — שאריות שזוהו בפירוק לכל שארית (איכותני)
קומפלקס	שארית	כיוון
LCA-VDR/1DB1	ליגנד (LCA)	מועיל
LCA-VDR/1DB1	Gln317	מועיל
LCA-VDR/1DB1	Trp286	בלתי מועיל
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	מועיל (דומיננטי)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	רשת מעורבת/מפוזרת
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	מועיל מאוד (קיטבי/אלקטרוסטטי)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	מועיל מאוד (קיטבי/אלקטרוסטטי)

טבלה 10: פירוק MM-PBSA לפי שארית. תקציר קצר: שאריות מייצבות ומדסטביליזריות (תרומה מוחלטת של ≥ 0.5 kcal mol⁻¹) עבור כל אחד מחמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד שסומנו בעדיפות, כולל מערכת ה-tryptamine-HTR2A המוטמעת בממברנה.מקור: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (פירוק לפי שארית של כלי חישוב אנרגיית קישור של מולקולרית-מכניקה/ממס-רצף (continuum-solvent) מסוג Generalized Born (GB), 'Complex: Total Energy Decomposition'). מספרי השאריות הומרו מהמספור הפנימי של המערכת שנבנתה ב-CHARMM-GUI (היסט של +68) למספור ה-PDB המקורי של 6A93 המשמש במקומות אחרים בכתב יד זה.

מקור: נתוני סימולציית MD קודמים/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg ותוצאות כתב היד (אנרגיית קישור חופשית בשיטת MM-PBSA ופירוק לפי שארית). לארבעה קומפלקסים אלו אין פלט מספרי בפורמט .dat/.csv לכל שארית בספריית הפרויקט (קיימים רק גרפי SVG מרונדרים עם טקסט בנתיב וקטורי שאינו ניתן לחילוץ ממוחשב); רק זהות השארית וכיוון מיטב/שאינו מיטב, כפי שצוין בטקסט של כתב היד, מדווחים. תרומות מדויקות ב-kcal/mol עבור ארבעה קומפלקסים אלו אינן זמינות במאגר המקור.

דיון

מחקר חישובי גשש זה מדגים תהליך עבודה (workflow) משולב וניתן לשחזור לתעדוף גנים של המארח הקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים ומכלולי חלבון-ליגנד, אשר יושם כאן על מערך נתונים טרנסקריפטומי של רירית הרקטום מחולים עם IBS-C ממאגר נתונים ציבורי. באמצעות תהליך עבודה זה, תת-קבוצה של גנים שנחזו כקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים חפפה לגנים שהיו במצב של ביטוי מופחת (downregulated) באופן עקבי במערך הנתונים, והם התקבצו בתוך מסלולים של GPCR, מערכות סרוטונירגית, איתות סידן, ליגנד-רספטור נוירו-אקטיבי ורספטורים גרעיניים, מערכות המעורבות יותר ויותר בתקשורת בין המיקרוביוטה למארח^48,49. ממצאים אלה יש לפרש אך ורק כיוצרי היפותזות: הניתוח אינו מודד ריכוזי מטבוליטים מיקרוביאליים, שפע של חלבוני רספטור, קישור ליגנדים, הפעלת רספטורים, איתות במורד המסלול, מוטיליות, הפרשה, תגובות כאב או תוצאים קליניים. המסקנה החזקה והנתמכת ביותר היא שהגנים והמסלולים שזוהו הם מועמדים לאישור ניסויי ולא מנגנוני מחלה מאושרים.

החשיבות הקריטית של פרוטוקול זה, ביחס לעבודות קודמות שבחנו זוגות בודדים של מטבוליט-רצפטור בבידוד, טמונה בשילוב של חיזוי מטרות, טרנסקריפטומיקה ציבורית, ניתוח רשתות, עגינה (docking) עם בקרות תיקוף, דינמיקה מולקולרית ו-MM-PBSA לכדי צינור סדרה (pipeline) אחד לתעדוף. כל שלב מצמצם ומספק הקשר לקבוצת המועמדים שהופקה בשלב הקודם, והסינון הסדרתי הוא זה שהופך את רשימת המועמדים הסופית לניתנת לבדיקה ניסיונית. מודול ה-GPCR הממוקד ב-GNAQ והמודול הקשור לרצפטור הסרוטונין שזוהו כאן הם סבירים מבחינה ביולוגית, בהתחשב בתפקידו של שגשוג Gq בהפעלה של phospholipase C, ייצור של inositol 1,4,5-trisphosphate, גיוס סידן, הפרשה ותפקוד אנטרואנדוקריני, ובשל התפקידים המוכרים של איתות המבוסס על חומצות שומן קצרות שרשרת ועל טריפטופן בהומאוסטזיס של הרקמה הרירית, ושל איתות סרוטונירגי בניידות מערכת העיכול, בהפרשה, ברגישות ויסצרלית ובתקשורת בין המעי למוח^10,18,50,51.

מאפיין מתודולוגי מרכזי של מחקר זה הוא הטיפול ברצפטור HTR2A המשובץ בממברנה. מכיוון שסימולציה בשלב מומס אינה יכולה לשחזר את סביבת הליפידים השולטת בהתנהגות הקונפורמציונית של רצפטור המצומד לחלבון G, קומפלקס tryptamine-HTR2A סומולץ בשכבה כפולה מפורשת של POPC. בסביבת ממברנה זו, הרצפטור נשאר יציב מבנית לאורך כל מסלול הסימולציה של 200 ns, וגשר המלח בין קבוצת האמוניום של ה-tryptamine ל-Asp155 (D3.32) נשמר למעשה לאורך כל הסימולציה. העובדה ששלוש הוכחות בלתי תלויות – תנוחת העגינה (docking pose), מרחק המגע העקבי לאורך המסלול, והתרומה הדומיננטית של כל שארית בחישוב MM-PBSA – מתכנסות לאותה אינטראקציה שמורה עם D3.32, מעניקה עקביות פנימית למודל קישור ה-tryptamine שנחזה, המשחזר את גיאומטריית הקישור הקנונית של ליגנדים אמינרגיים ברצפטורים של סרוטונין.

ישנם מספר שיקולים מתודולוגיים שיש להביא בחשבון בעת שחזור תהליך עבודה זה. שגיאות במבנה הקנוני או תרכובות המסומנות כ-Pan-assay interference compounds ((PAINS)) מופצות דרך חיזוי מטרות ועגינה (docking), מה שדורש בחירה מדויקת של מטבוליטים ואוצרות כימואינפורמטית. יש לצמצם סטים של מטרות המונעות על ידי רעש באמצעות החלה עקבית של קריטריוני הביטחון (חיזוי מטרות של אינטראקציית כימיקל-חלבון: ≥0.700; תוכנת עגינה מולקולרית: ≥0.70; בניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון והעשרה של מסלולים: ≥0.700). יש לקבץ את המטרות החזויות לפי קטגוריה תפקודית כדי למנוע אפיון שגוי של כל הגנים הקשורים למטבוליטים כרצפטורים. עיבוד מקדים מדויק של מבני PDB, מינימום אנרגיה של ליגנדים ומיקום רשת (grid) סביב שאריות קשירה ידועות הם היבטים חיוניים של העגינה, ובקרות ה-redocking וה-cross-docking המוצגות כאן מספקות מדד אובייקטיבי לנכונותה של מתודולוגיית העגינה. מעטפת השחזור בדינמיקה מולקולרית מוגדרת על ידי שילוב של פרמטריזציה של שדה כוחות (force-field), סולבציה תקינה או בניית ממברנה, שיווי משקל מדורג ודגימת ייצור נאותה.

התאמות טיפוסיות וצעדי פתרון בעיות כוללים הקלה בספי thresholds אם החיזוי של המטרה אינו מחזיר תוצאות, בדיקת העקביות הכיוונית ברמת הפרובה עבור גנים עם מספר פרובות, ופירוש של קשרי רשת בודדים בבניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון וצמתים של העשרה מסלולית ככאלה התלויים ב-threshold ולא כבלתי רלוונטיים ביולוגית. עבור רצפטורים של ממברנה, יש להשתמש בסימולציית שכבה דו-שומנית (lipid bilayer) מפורשת במקום בסימולציית תמיסות מימיות, כפי שמוסבר כאן בשיטת HTR2A. במקרים שבהם נדרש פירוק אנרגיה לכל שארית (per-residue energy decomposition), יש לבצע את החישוב באמצעות מנוע המסוגל לבצע פירוק, ויש להתאים את מספור השאריות המדווח למספור הרצפטור המקורי כדי למנוע דו-משמעות. אנו מציעים כי תוצאות של העשרה מסלולית יטופלו בצורה הטובה ביותר כהקשר ארגוני עבור רשימת המועמדים, ולא כתיקוף ברמת המסלול. מבחינה מכנית, העשרה של מונחי GPCR, serotonergic או איתות סידן תקרה בכל פעם שרשימת הגנים תכיל מספר גנים של רצפטור סרוטונין, ללא קשר לוויסות משותף (co-regulation) ברמת החלבון. יש לפרש את ערכי RMSD, Rg ו-RMSF עבור מערכת HTR2A המוטמעת בממברנה תוך התחשבויות בשכבה הדו-שומנית: ירידה ב-Rg במסלול (trajectory) המאוחר עשויה לשקף התאמה קונפורמציונית של צרור הטרנס-ממברנלי המונעת על ידי השכבה הדו-שומנית ולא פריסה גלובלית, ויש לפרש קשרי מימן עמידים בין הליגנד לחלבון יחד עם יציבות ה-RMSD הכללית.

המגבלות של מחקר זה הן משמעותיות ומגבילות את הפרשנות. המחקר התבסס על מערך נתונים ציבורי אחד קטן יחסית, וחיפוש במאגרי התמלול הציבוריים המרכזיים (כלי ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי מבוסס רשת ו-ArrayExpress) לא זיהה מערך נתונים עצמאי של תמלול רירית רקטום של IBS-C בעל עיצוב ופלטפורמה דומים שיכול היה לשמש כקבוצת שכפול במועד הניתוח. היעדר שכפול תמלול עצמאי הוא מגבלה מרכזית, ואין לפרש කිසි מההצהרות בכתב יד זה כתיקוף חיצוני של הממצאים ממערך הנתונים הבודד. מערך הנתונים מראה ביטוי דיפרנציאלי כמעט אוניברסלי (כ-94.5% מהגנים הם מובהקים, כאשר רובם המכריע הם בעלי ביטוי מופחת), תכונה ההופכת סטטיסטיקות העשרה קונבנציונליות לבלתי אינפורמטיביות ומונעת מסקנות לגבי הספציפיות של הפחתת הביטוי של גני מטרה ביחס לרקע הגנומי; לפיכך, החפיפה מדווחת כדפוס כיווני תיאורי ולא כהעשרה סטטיסטית. תמלול רירית מסוג Bulk אינו יכול להבחין בין ויסות גנים ממשי לבין שינויים בהרכב התאים. ביטוי mRNA אינו קובע את שפע החלבון או את התגובה התפקודית. מאגרי נתונים לחיזוי מטרות סובלים מהטיית אנוטציה, ותוצאות של docking, MD ו-MM-PBSA תלויות בבחירת השדה של הכוח (force field), פרמטריזציה של הליגנד, נקודת ההתחלה, זמן הסימולציה ומספיקות הדגימה. מזהי גרסה/בנייה מדויקים עבור חלק מרכיבי שרתי הרשת והחבילות, כולל שירות פרמטריזציה של ליגנדים תואם CHARMM, CHARMM-GUI וסביבת מחשוב סטטיסטי

גרסאות החבילות (package builds) והגרסאות המשניות של כלי חישוב אנרגיית הקשירה בשיטת המכניקה מולקולרית/ממס solvent-continuum לא היו ניתנות לשחזור מלא מרשומות הפרויקט שנשמרו, ויש לדווח עליהן כזמינות בטבלת החומרים הנפרדת. ערכי MM-PBSA הם הערכות יחסיות, אינם כוללים איבר מפורש של אנטרופיה קונפיגורציונית, ואין לפרשם כאפיניות ניסויית. המחקר חסר נתונים מטבוליים ואינו יכול לקבוע האם הזמינות של ליגנדים משתנה ב-IBS-C, או האם השינויים שנצפו בביטוי הם סיבות, תוצאות, תגובות פיצוי או קורלציות חסרות רלוונטיות.

יישומים עתידיים של שיטה זו צריכים לכלול שחזור טרנסקריפטומי עצמאי, תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ותיקוף ברמת החלבון, מיקום סוגי תאים באמצעות טרנסקריפטומיקה של תא בודד או טרנסקריפטומיקה מרחבית, פרופיל מטבולומי של מחלקות המטבוליטים הרלוונטיות, ובדיקות תגובה פונקציונליות לליגנדים בקולונידים המופקים מחולים, תרביות של רקמת רירית (explants) או מודלים דומים. השוואות עם קבוצות של IBS עם דומיננטיות לשלשול, IBS מעורב, מחלות מעי דלקתיות ועצירות שאינה קשורה ל-IBS^1,2 יעזרו בביסוס הספציפיות למחלה. עבור הרכיב המבני, שחזור מסלולי MD, ביצוע אנליזות רגישות עם תנוחות התחלה חלופיות, ותיעוד מלא של הפקדת הטופולוגיה, המסלולים וקבצי הקלט והפלט של MM-PBSA יחזקו עוד יותר את השחזוריות. בדיקות תגובה ניסיוניות לליגנדים נותרות הכרחיות כדי לקבוע האם הקומפלקסים שקיבלו עדיפות הם רלוונטיים מבחינה פונקציונלית; התוצאות הנוכחיות אינן תומכות בטענות קליניות או טיפוליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AutoDock Vina	Scripps Research / קוד פתוח	v1.2.7; https://vina.scripps.edu/	עגינה מולקולרית (Molecular docking) של ליגנדים מטבוליים לחלבונים מטרה.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / אוניברסיטת מרילנד	v4.6; https://cgenff.com/	פרמטריזציה של שדה כוחות לליגנדים עבור דינמיקה מולקולרית.
CHARMM36m force field	מפתחי CHARMM / קוד פתוח	CHARMM36m; https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	שדה כוחות לחלבונים המשמש לסימולציות של דינמיקה מולקולרית.
CHARMM-GUI Membrane Builder	CHARMM-GUI / אוניברסיטת ליהיי	שרת רשת; גרסה מדויקת אינה ניתנת לשחזור; https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	בנייה והגדרת שיווי משקל של מערכת ממברנת POPC מפורשת.
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)	2021; https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	ניתוח דו-ממדי של אינטראקציות בין ליגנד לשאריות חלבון.
GEO2R	NCBI Gene Expression Omnibus	כלי רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של GSE36701.
GeneCards	מכון ויצמן למדע	מאגר נתונים ברשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.genecards.org/	אימות סמלי גנים ומידע על גנים במהלך סטנדרטיזציה של מטרות.
gmx_MMPBSA	קוד פתוח (Valdés-Tresanco et al.)	1.5.x; https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	הערכת אנרגיית קשירה חופשית בשיטת MM-PBSA ופירוק לפי שארית.
GROMACS	צוות פיתוח GROMACS / קוד פתוח	2024.2; https://www.gromacs.org/	מנוע לסימולציית דינמיקה מולקולרית.
GSE36701 transcriptomic dataset	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE36701; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	מאגר נתוני ביטוי ציבורי של רירית רקטום IBS-C.
Open Babel	קוד פתוח	3.2.0; https://openbabel.org/	המרה של פורמטים של קבצים כימיים, יצירת ליגנדים תלת-ממדיים והכנת ליגנדים.
OPM database	אוניברסיטת מישיגן	מאגר נתונים ברשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://opm.phar.umich.edu/	קואורדינטות של Orientation of Proteins in Membranes המשמשות ליישור של HTR2A.
ParmEd	מפתחי ParmEd / קוד פתוח	4.x; https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	חלוקה מחדש של מסת מימן ועיבוד טופולוגיה לסימולציה מולקולרית.
PyMOL	Schrödinger / קוד פתוח	2.x; https://www.pymol.org/	ויזואליזציה מבנית תלת-ממדית ואיורי רספטור-ליגנד.
RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	מאגר נתונים ברשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.rcsb.org/	מקור למבני חלבונים ניסיוניים וקואורדינטות PDB.
STITCH	קונסורציום STITCH (EMBL)	v5.0; https://stitch.embl.de/	חיזוי מטרות לאינטראקציות כימי-חלבוניות.
STRING	קונסורציום STRING / ELIXIR	v12.0; https://version-12-0.string-db.org/	בניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרה של נתיבים.
SwissADME	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / אוניברסיטת לוזאן	כלי רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.swissadme.ch/	דסקריפטורים כימואינפורמטיים, תחזיות פרמקוקינטיות והערכת PAINS.
SwissTargetPrediction	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / אוניברסיטת לוזאן	כלי רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.swisstargetprediction.ch/	חיזוי מטרות חלבון אנושי המבוסס על ליגנדים.
UniProt ID Mapping	קונסורציום UniProt	שירות רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.uniprot.org/id-mapping	מיפוי מזהי חלבונים לסמלי גנים סטנדרטיים מאושרים על ידי HGNC.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; גרסת CUDA/דרייבר לא צוינה במאמר	מעבד גרפי תומך CUDA ששימש לסימולציות של דינמיקה מולקולרית.
CUDA-compatible GPU	NVIDIA Corporation	גרסת CUDA toolkit לא צוינה במאמר; ≥8 GB VRAM	GPU תומך CUDA עם ≥8 GB VRAM; תחנת העבודה דרשה גם ≥32 GB RAM ומעבד בעל 6 ליבות.
Ubuntu Linux	Canonical Ltd. / קוד פתוח	22.04 LTS	מערכת הפעלה לינוקס 64 סיביות.
Python 3.9	Python Software Foundation	3.9	סביבת תכנות למטרות כלליות ששימשה לכתיבת סקריפטים של זרימת עבודה וניתוח.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI / הספרייה הלאומית לרפואה של ארה"ב	מאגר רשת ציבורי; גרסת תוכנה לא צוינה במאמר	מאגר נתוני גנומיקה פונקציונלית ציבורי.
AutoDockTools/MGLTools	מעבדה לגרפיקה מולקולרית, Scripps Research	1.5.7	ערכת כלים להכנת מבנה מולקולרי וקלט לעגינה.
GROMACS analysis tools	צוות פיתוח GROMACS / קוד פתוח	2024.2	כלי עזר לניתוח מסלולי דינמיקה מולקולרית.
CHARMM-GUI six-step protocol	CHARMM-GUI / אוניברסיטת ליהיי	פרוטוקול רשת; גרסה מדויקת אינה ניתנת לשחזור	תהליך עבודה רב-שלבי מבוסס רשת להכנה ושיווי משקל של מערכות מולקולריות.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	סקריפט המרה בקוד פתוח; המקור לא צוין במאמר	גרסה לא צוינה במאמר	סקריפט להמרת טופולוגיה של שדה כוחות.
Python	Python Software Foundation	3.9	סביבת תכנות למטרות כלליות.
SciPy	קהילת SciPy / קוד פתוח	גרסה לא צוינה במאמר	ספריית מחשוב מדעי.
scipy.stats.fisher_exact	קהילת SciPy / קוד פתוח	גרסת SciPy לא צוינה במאמר	מימוש של מבחן פישר המדויק (Fisher’s exact test).
R	R Foundation for Statistical Computing	4.3.x	סביבת מחשוב סטטיסטי.
Bioconductor	פרויקט Bioconductor / קוד פתוח	3.18	מסגרת תוכנה לביואינפורמטיקה.
limma	פרויקט Bioconductor / קוד פתוח	גרסה לא צוינה במאמר	חבילה לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי.
Benjamini–Hochberg procedure	שיטה סטטיסטית	לא רלוונטי (הליך סטטיסטי)	שיטת התאמה של שיעור התגליות השגויות (FDR).
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; גרסת CUDA/דרייבר לא צוינה במאמר	מעבד גרפי עם לפחות 8 GB של זיכרון וידאו.
CUDA-compatible GPU	NVIDIA Corporation	גרסת CUDA toolkit לא צוינה במאמר; ≥8 GB VRAM	מעבד גרפי התומך בחישוב מקבילי למטרות כלליות.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	Canonical Ltd. / קוד פתוח	22.04 LTS	מערכת הפעלה לינוקס 64 סיביות.
TIP3P	מפתחי שדה כוחות CHARMM / קוד פתוח	TIP3P; גרסת תוכנה לא רלוונטית	מודל מים מפורש בעל שלושה אתרים.
MM/PBSA	מפתחי gmx_MMPBSA / קוד פתוח	gmx_MMPBSA 1.5.x	שיטת אנרגיית קשירה של מכניקה מולקולרית/שטח פני פואסון–בולצמן.