מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק
12 במאי 2009
במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.
על מנת למדוד את תוחלת החיים ב-C. elegans, יוצרים אוכלוסייה מסונכרנת בגיל באמצעות השחאת ביצים מתוזמנת. תולעים הרמפרודיטיות בוגרות ופעילות מועברות לצלחות מצע גידול לנמטודות (NGM) הזרועות ב-E. coli שהורג ב-UV, ומושארות להטלת ביצים למשך שש עד שמונה שעות ולאחר מכן מוסרות. במהלך יומיים, התולעים בוקעות מביצים אלו וגדלות עד לשלב הזרקים L4. תולעי L4 מועברות לצלחות NGM חדשות המכילות אמפיסילין למניעת זיהום בחיידקים חיים ו-FUDR למניעת רבייה, ומושארות להתפתח לבוגרים.
מנקודה זו ואילך, התולעים הבוגרות נבחנות מדי יומיים עד שלושה ימים עד שכל התולעים מתות. בכל נקודת זמן, התולעים המתות מוסרות מהצלחת ומספר התולעים החיות והמתות נרשם. אני ג'ורג' סטון מהמעבדה של מאט קפליין במחלקה הפתולוגיה באוניברסיטת וושינגטון.
היום נדגים לכם כיצד למדוד תוחלת חיים ונראה את ה-hepatitis elegance שלנו. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הגנטיקה של ההזדקנות. אז בואו נתחיל.
ניסוי תוחלת חיים בסיסי דורש שני סוגי מצעים: מצעי NGM סטנדרטיים, שאינם מכילים תוספים, ומצעי AMP FUDR, שבהם נוספו ל-NGM גם אמפיסילין וגם פלואורו-דאוקסי-אורידין. שני סוגי המצעים מזורעים בחיידקי e coli OP 50, שמומתים לאחר מכן בחשיפה ל-uv. התחל בהכנת 10 milliliters של תמיסת NGM.
עבור כל צלחת פטרי בקוטר 60 millimeter, המס לחלוטין את ה-NGM המוצק באמצעות חימום במיקרוגל בהספק גבוה בפולסים של 32 שניות. סובב את המצע בין הפולסים כדי למנוע הצטברות של בועות גז בלחץ, והנח את ה-NGM הנוזלי באמבט מים בטמפרטורה של 55 degree Celsius או על השולחן כדי לאפשר למצע להתקרר. ברגע שהמצע התקרר ל-55 degree Celsius, נקודה שבה תוכל להחזיק את כלי הזכוכית בידיים חשופות בנוחות, הוא מוכן להוספת תרופות.
ולשפוך את הצלחות עבור צלחות עם תרופות, הוסיפו 33 µL של 150 mM FUDR ו-100 µL של 100 mg/mL Ampicillin לכל 100 mL NGM וסובבו לערבוב; Ampicillin משמש למניעת זיהום חיידקי חיצוני ו-FUDR למניעת בקיעת ביצים. כך לא יהיה צורך להעביר את התולעים מדי כמה ימים כדי להפריד אותן מזחלים הגדלים.
כעת מזגו את המצע והניחו לצלחות להתייבש על שולחן העבודה במשך יומיים. ביום שלפני סיום ייבוש הצלחות, זרעו תרבית נוזלית של LB עם מושבה בודדת ממריחה טרייה של חיידקי e coli. OP 50 בתוך LB auger. הכינו לפחות 0.5 milliliter תרבית לכל צלחת של 60 millimeter.
העבירו את תרבית ה-OP 50 למנער בטמפרטורה של 37 degree Celsius והניחו לחיידקים לגדול למשך לילה. למחרת, השקיעו את חיידקי ה-OP 50 באמצעות כוח צנטריפוגלי של 3,500 g למשך 10 דקות. שפכו כמות מספקת מהנוזל העליון (supernatant) כדי לתרחף מחדש את החיידקים בריכוז של 10 x.
כעת, חסנו כל צלחת עם 100 µL של התרבית המרוכזת. הימנעו ממגע של קצה הפ pipette עם פני השטח של ה-NGM, שכן פגמים במצע יאפשרו לתולעים לחפור; סובבו את הצלחות עד שהחיידקים מכסים את האזור המרכזי של ה-NGM מבלי להתקרב לדפנות הצלחת, והשאירו את הצלחות להתייבש על השולחן למשך 24 שעות. לאחר הייבוש, חשפו את פני השטח של הצלחות למינון UV חזק מספיק כדי לעצור את הצמיחה החיידקית; אנו משתמשים ב-strata gene UV straddle linker 2, 400.
התחילו בהטענת הפלטות במקשר הדילוג (straddle linker) ללא המכסים שלהן. כעת לחצו על energy. הקישו 9 9 9 9 במקלדת ולחצו על start.
הצלחות ייחשפו לקרינת UV למשך כחמש דקות. ניתן לאחסן צלחות עם חיידקים שהורגו ב-UV כשהן הפוכות בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש. סעיף זה מתאר כיצד להפיק אוכלוסייה של תולעים עם תאריך בקיעה משותף.
התחילו בהעברה של כ-20 תולעים בוגרות צעירות לצלחת NGM רעננה ללא תרופות. השאירו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך כשבוע כדי לאפשר לתולעים להתרבות ולאכול את כל המזון הבקטריאלי תוך שבוע. כאשר יופיעו תולעים שבקעו לאחרונה בשלב ה-dower שבו הצמיחה נעצרת, יש להעביר 20 עד 30 לרוות dower לצלחת NGM רעננה ללא תרופות ולהדגיר אותן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בנוכחות מזון.
הזחלים הבוגרים יהפכו למבוגרים פעילים רביייתית תוך יומיים ויישארו פעילים רביייתית למשך מספר ימים לאחר מכן. כעת העבירו 10 עד 15 מהמבוגרים הפעילים רביייתית לצלחת NGM רעננה ללא תרופות. צלחת זו מכונה צלחת הנחת ביצים מתוזמנת או צלחת TEL.
השאירו את פלטת ה-TEL בטמפרטורה של 25 degrees Celsius כדי שהתולעים יוכלו להטיל ביצים. בעלי החיים שיבבקו מביצים אלו יהיו בעלי החיים הניסוייים, ומשך חייהם יימדד לאחר שש שעות. בדקו את פלטת ה-TEL כדי לוודא קיום של ביצים.
אם טרם הוטלו מספיק ביצים, השאירו את לוח ה-TEL בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך זמן כולל של עד 24 שעות, תוך בדיקה תקופתית של נוכחות ביצים. כאשר הוטלה כמות מספיקה של ביצים, הסירו את הבוגרים מלוח ה-TEL.
ניסוי אורך חיים טיפוסי ידרוש בין 30 ל-90 ביצים לכל קבוצה ניסיונית, אך ניתן להפיק מספר מאות ביצים מלוח TEL בודד. כ-150 ביצים יונחו על ידי 10 עד 15 בוגרים פעילים רבייתית בתוך שש עד שמונה שעות. בעת השוואה בין קבוצות ניסיוניות, ניתן להגיע למובהקות סטטיסטית עבור הבדלי אורך חיים גדולים עם כ-30 בעלי חיים בלבד.
יש להשתמש במספר רב יותר של בעלי חיים כדי להבחין בהבדלים צנועים יותר. כעת, הניחו את לוח ה-TEL ללא הבוגרים בטמפרטורה של 20 °C עד שהביצים יבבקו והתולעים יתפתחו לשלב הלרבה L4. תהליך זה אורך בדרך כלל יומיים עבור C elegance מסוג wild type, אך עשוי להימשך זמן רב יותר עבור זנים בעלי פנוטיפים של התפתחות איטית.
סעיף זה מתאר כיצד לעקוב אחר מהלך חייהם של אוכלוסיות מסונכרנות גיל. ראשית, העבירו את הלרוות בשלב L4 מצעיל ה-TEL לצעילי AMP FUDR מוכנים. עבור כל זן או תנאי שנבדקים, נהוג להכין שתיים עד שלוש צלחות עם 25 עד 30 תולעים בכל צלחת.
דגרו את צלחות ה-AMP FUDR בטמפרטורה של 20 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, בצעו הערכה ויזואלית של התולעים, המצע והחיידקים, והעבירו את התולעים לצלחות AMP FUDR טריות. אם התולעים אכלו את רוב המזון החיידקי, פעולה זו תתבצע בדרך כלל פעם או פעמיים בשבוע.
בשלבים מוקדמים של הניסוי, אם נוכח מספר משמעותי של לרוות, הדבר מעיד בדרך כלל על כך שהתולעים הועברו לצלחות AMP FUDR כבוגרים צעירים במקום כשלב L4. בוגרים צעירים עלולים להטיל ביצים לפני שנכנס ה-FUDR לתוקף, ומדי פעם לרוות חומקות מהשפעות ה-FUDR וגדלות לבוגרים. במצב זה, לרוות אלו יסיבקו את תוצאות הניסוי; במקרה כזה, העבירו את התולעים הבוגרות לצלחות טריות והשליכו את הצלחות הישנות המכילות את הלרוות.
יש להעביר את התולעים לצלחות רעננות גם אם נצפה גדילה של חיידקים חיים. בדרך כלל השילוב של AMP והריגה באמצעות UV יבטיח שחיידקים חיים לא יזהמו את הניסוי, אך לעיתים הדבר קורה. כמו כן, העבירו את התולעים.
במידה ונצפתה צמיחה פטרייתית על המצע. אם הדבר מזוהה בשלב מוקדם מספיק, ניתן להסיר את הפטרייה באמצעות טיפ של פיפטה או שפכטל. ברגע שהצמיחה גדלה למשקף של יותר ממספר מילימטרים בקוטר, בדרך כלל קל יותר להעביר את התולעים לצלחת חדשה.
בצעו דירוג של אורך החיים עבור כל התולעים מדי יומיים עד שלושה ימים. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה, קבעו האם כל תולעת חיה או מתה.
הקש בעדינות על הצלחת. התולעת חיה אם היא נעה בתגובה להקשה. אם התולעת אינה מגיבה להקשה על הצלחת, בצע זום לאזור הראש והקש בעדינות על ראש התולעת באמצעות פיקת העברה מפלטינה.
סמן את התולעת כמתה. אם היא אינה מגיבה באמצעות תנועת הראש, הסר את התולעת המתה מהצלחת. לאחר בדיקת כל התולעים, רשום את התאריך ואת מספר התולעים החיות והמתות.
תולעים המגודלות על מצע מוצק עלולות מדי פעם לברוח מפני השטח של הצלחת על ידי חפירה או זחילה במעלה הדופן. תולעים שנמלטו מושמטות לחלוטין מהמחקר. עם הסיום, החזירו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 degrees Celsius.
המתינו יומיים עד שלושה ימים נוספים ולאחר מכן בדקו שוב את הצלחות הפטריה. המשיכו במשטר זה עד שכל התולעים ימותו. מספר התולעים שמתות בכל יום נהפך בדרך כלל כדי לחשב את פרופורציית התולעים החיות בכל יום, ונתונים אלו מוצגים גרפית כעקומת הישרדות תוך התחשבות ביום של הנחת הביצים המתוזמנת.
יום אפס. תוחלת החיים החציונית הטיפוסית עבור זן הבר (wild type) של *C. elegans*, המגודל על מצע NGM עם חיידקים שהוקטלו באמצעות UV בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, היא כ-25 ימים, כפי שנמדד החל משלב הביצה.
הרגע הדגמנו כיצד למדוד את תוחלת החיים ולהבחין באלגנסיות. ניתן לשנות פרוטוקול בסיסי זה כדי לבחון מגוון תנאים סביבתיים, כולל הגבלה תזונתית והשתקת RNA (RNA interference), הנושאים הנדונים בטקסט התומך. זהו סיכום התהליך.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למדידת תוחלת החיים של נמטודות המגודלות על מצע מוצק עם מזון חיידקי שהושבת באמצעות קרינת UV. השיטה כוללת יצירת אוכלוסייה מסונכרנת גיל וניטור תוחלת החיים של תולעים בוגרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- נמטודות נמצאים בשימוש נפוץ במחקרי אורך חיים.
- חיידקים שנהרגו על ידי קרינת UV משמשים כמקור מזון ללא הסיכון של זיהום בחיידקים חיים.
- סנכרון גיל הוא חיוני למדידה מדויקת של תוחלת החיים.
- הפרוטוקול מאפשר תצפית שיטתית על תמותת התולעים.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה למדידת תוחלת חיים בנמטודות.
- שימוש בחיידקים שהושמדו באמצעות UV כמקור מזון בטוח.
- תרומה להבנת תהליכי הזקנה באורגניזמי מודל.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת אוכלוסיית C. elegans מסונכרנת גיל באמצעות הטלה מתוזמנת של ביצים.
- העברת תולעים הרמאפרודיטיות בוגרות לצלחות מצע גידול לנמטודות.
- שימוש באמפיסילין וב-FUDR למניעת זיהום ורבייה.
- תצפית ורישום קבועים של תולעים חיות ומתות.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של פרוטוקול למדידת תוחלת חיים.
- שימוש יעיל בחיידקים שהומתו באמצעות UV כמקור מזון.
- מעקב מדויק אחר תמותת תולעים לאורך זמן.
- תובנות לגבי דינמיקת תוחלת החיים של C. elegans.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך למחקרי אורך חיים בנמטודות.
- חיידקים שהושמדו באמצעות UV מהווים חלופה חלופית למקורות מזון חיים.
- שיטה זו יכולה לשפר את המחקר על הזדקנות ואורך חיים באורגניזמי מודל.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מדידת תוחלת החיים ב-C. elegans מספקת מערכת לניבוי בעלת תפוקה גבוהה לתיקוף מטרות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות הקשורות להזדקנות. הפרוטוקול מאפשר הערכה כמותית של התערבויות גנטיות וסביבתיות על אריכות הימים, ובכך תומך בבחינת השערות בשלבים מוקדמים ובמיון פורטפוליו. יכולת ההרחבה והשחזור שלו הופכות אותו למתאים לשילוב בתהליכי גילוי המתמקדים במסלולי הזדקנות ובזיהוי סממנים ביולוגיים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי הזדקנות ומנגנוני אריכות ימים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אספקת מדדים פונקציונליים של השפעת המודולציה של המטרה על תוחלת החיים.
- ערך ניבוי: מייצר נתוני הישרדות כמותיים להערכת מידת הביטחון במטרה ותיעדוף מובילים להמשך תיקוף.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות וסטנדרטיות של תוחלת חיים המתאימות לסריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות של הבדיקה באמצעות אוכלוסיות מסונכרנות גיל ותנאים מבוקרים (חיידקים שהורגו ב-UV, FUDR, own ampicillin).
- יכולת הרחבה: תואם לפורמטים של פלטות או בארות מרובות להגברת התפוקה במסעות לזיהוי מובילים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשר בין ממצאים משלב הגילוי לאימות פרה-קליני באמצעות מסלולי הזדקנות שמורים.
- סנכרון סמנים ביולוגיים: תומך בזיהוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים המתואמים עם הארכת תוחלת חיים או עיכוב ההזדקנות.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) בהתבסס על השפעה מדידה על טווח הבריאות (healthspan) וקינטיקה של תמותה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור התערבויות לוויסות ההזדקנות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרת מסלולים על ידי מדידת התגובה של האורגניזם להפרעות גנטיות או פרימקולוגיות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים המניבים עקומות הישרדות כמותיות ועקביות.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני תמותה לרוחב זמן המאפשרים השוואה סטטיסטית של התפלגויות הישרדות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים לרלוונטיות פרה-קלינית באמצעות שימור אבולוציוני של ווסתי הזקנה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי הזקנה לרוחב זמן על פני מספר פרויקטים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף יעדים על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במודלים של הזדקנות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות תוחלת חיים בין צוותים ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של יעדי אריכות חיים לפני השקעה פרה-קלינית יקרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף ובהחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על תוצאות אמפיריות של תוחלת חיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-C. elegans, סנכרון גיל והערכת חיות תחת מיקרוסקופ.
- תלוי בגישה לאינקובטורים, לציוד להקרנה ב-UV ולמיקרוסקופי דיסקציה למעקב לאורך זמן.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של קריטריוני ההערכה ותנאי הסביבה (טמפרטורה, הרכב המצע).
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על רקעים גנטיים שונים או גורמי עקה סביבתיים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון חפירה או בריחה של התולעים, העלולות לדרוש התאמות בפרוטוקול כדי לשמור על שלמות הנתונים.
