מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק
29 ביוני 2009
פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה Ca 2 + הדמיה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים, לרבות: הכנת הרכישה, תמונה רקמות וניתוח נתונים.
ראשית, מכינים תמיסת טעינה של סידן, מחממים אותה ומבעבעים אותה. מבודדים את שלפוחית השתן, פותחים אותה, מקבעים אותה בצורה שטוחה בעזרת סיכות, וגוזרים פס רצועה של שריר הדטרוסור. מוסיפים את רצועת הדטרוסור לתמיסת הטעינה, מדגירים אותה, שוטפים אותה ומקבעים אותה בצורה שטוחה בעזרת סיכות.
רמת הסידן הבסיסית ברקשה תעוררה על ידי אור לייזר, והאור הנפלט נקלט. סרטים המורכבים מפריימים בודדים מנותחים על ידי השוואה בין פריימים עוקבים. הרקע מופחת.
סף קצה התא קובע היכן ניתן למצוא אירועים, ונלקח יחס בין מוחות עוקבים. אם האירועים שנותרו תואמים לקריטריונים שהוגדרו מראש, הם מודגשים ומסומנים. שלום, שמי ג'ון יאנג מהמעבדות של קית' בריין וטום קינאן במחלקה לפארמקולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד.
אני רוב אמוס, גם אני ממעבדות Brain ו-Canne, ושמי קית' בראיין. היום, ג'ון ורוב ידגימו לכם טכניקה של דימוי סידן בשריר חלק. אנו משתמשים בשיטה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את השחרור של מוליכים עצביים מעצבים אוטונומיים ואת השפעתם על השריר החלק.
בואו נתחיל. האינדיקטור לסידן Organ Green 488 Bapta-1 AM מגיע בבקבוקונים של 500 µL המכילים 50 µg של אבקה. כדי להכין את האינדיקטור לסידן, הוסיפו 40 µL של תמיסת Onic F1 27 לאבקה ונערה בעדינות במשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 460 µL של תמיסת סליין פיזיולוגית (PSS), ונערה בעדינות למשך 30 שניות נוספות.
התמיסה הסופית, 10 µM של organ green 488 BAFTA, מספקת ארבע מנות (aliquots) של 125 µL כל אחת. יש למנוע חשיפה לאור ולאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 20- °C לפני דיסקציה של הרקמה הרלוונטית.
הוצא את אינדיקטור הסידן מהמקפיא והפשר בטמפרטורת החדר בעוד אינדיקטור הסידן דליל. העבר מיליליטר אחד של PSS למבחנה ואמבט מים בטמפרטורה של 33 °C. הדק בורבולה למבחנה באמצעות פקק, או שניתן להשתמש בפילטר, ולאחר מכן בצע בובלינג עם תערובת של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide בקצב של בועה אחת בערך לשנייה.
בצעו דיסקציה של איבר השריר החלק מהבעל החיים. במקרה זה, מדובר בשלפוחית השתן של עכבר. הניחו את האיבר בערך ב-50 millimeters של PSS לשטיפה. לאחר שטיפת הרקמה, הסירו בזהירות את הרקמה השומנית ורקמת החיבור.
בצעו דיסקציה ופתחו את שלפוחית השתן בהתאם לסוג השריר החלק של laurean. פתחו לאורכה מצוואר השלפוחית, הקצה העטוף (coddle end), ועד לראש כיפת השלפוחית (dome). בקצה הקרניאלי (cranial end), הכינו ארבעה רצועות, באורך 6 עד 8 מילימטרים וברוחב 1 עד 2 מילימטרים, לאורך המשטח הגבי של ה-resser, תוך חיתוך בכיוון צמעי השרירים הדומיננטיים.
הניחו את הרקמה המנוסחת ואת ה-PSS שחומם מראש והובעבב כדי להטעין את אינדיקטור הסידן, על ידי הוספת 125 µL של organ green 488 B בריכוז 10 µM לרקמה בתוך מבחנה, ונערה קלות ביד כדי לערבב. החזירו את המבחנה לאמבט המים. חזרו להבעבוב וכסו את אמבט המים בגיליון נייר אלומיניום.
הזמן הדרוש לספיגה מספקת של אינדיקטור הסידן ברקמה משתנה בהתאם לגודל הרקמה ולעובי שכבת השריר החלק. לדוגמה, עבור השריר הדטרוסור של עכבר ו-oxs של חולדה, הזמן הוא 70 דקות. לעומת זאת, עבור השריר הדטרוסור של חולדה ו-VAs deens של עכבר, אנו מדגירים במשך 120 דקות.
לאחר טעינת הרקמה עם המדד לסידן (calcium indicator), ניתן להכינה למיקרוסקופיה. ראשית, שטפו את הרקמה ב-PSS מאוורר בבועות למשך 10 דקות. לאחר מכן, מקמו את הרקמה בתוך צלח הכנה עם הגנת S (S guard).
מתוחו את הרקמה מעט כדי ליצור גיליון שטוח. 고בעצרו את הרקמה באמצעות קטעים קצרים, למשל, שני מילימטרים של חוט כסף בקוטר 25 עד 50 µm, והחדירו את הנעצים בזווית.
הימנעו משימוש בסיכות שאורכן עולה על מספר מילימטרים, שכן הן עלולות לשרוט את העדשה. קיבוע זהיר של הרקמה באמצעות סיכות חשוב כדי למזער תנועה ספונטנית של הרקמה ולהקל על איתור אתר מתאים לדימות. לאחר קיבוע הרקמה, מקמו את צלחת ההכנה על במה המיקרוסקופ.
הקפידו שה-PSS לא יחרוג מהאזור המגודר ב-sil guard של הצלחית, שכן הדבר עלול להוביל לכיסוי של שטח רב ב-PSS. כאשר תתחיל הסופרפוזיה למטרות הדגמה, השלבים הבאים יבוצעו באור.
שימו לב שניסויים אלה מבוצעים בדרך כלל בחשכה. הפעילו את המשאבה כדי לבצע perfuse להכנה. עבור PSS, משתמשים לרוב בקצב של 100 milliliters per hour.
הפעל את יחידת החימום, והנח את צינורות הכניסה והיציאה ואת חיישן הטמפרטורה על צלחת ההכנה, תוך קיבוע של כל אחד מהם לפס המתכת באמצעות המגנט שבבסיסו. גובה הקצה של צינור היציאה יקבע את עומק ה-PSS. הקפד לוודא שמעמד היציאה אכן מסיר את ה-PSS, שכן לעיתים הדבר אינו קורה.
ראשית, הגדירו במכשיר החימום את הטמפרטורה הרצויה, שבין 33 ל-35 מעלות צלזיוס. אפשרו לרקמה להגיע לשיווי משקל למשך 10 דקות לפחות תחת עדשה בעלת הגדלה נמוכה, פי 10 או 20.
השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית או בהערכה באמצעות אור כחול כדי לצפות בשריר החלק ולזהות אזור מתאים למעקב. מכיוון שחשיפה להערכה והארה תגרום לפחיתה פוטו-כימית (photobleaching) של האינדיקטור, הימנעו משימוש למשך יותר מכמה שניות בכל פעם.
הימנעו מבחירה של אזורים עם מבנים בהירים, מכיוון שהם עלולים לגרום למספר גבוה של חיוביים שגויים באלגוריתם זיהוי התמונות. נסו לבחור אתר עם תנועה מינימלית ומספר רב של תאי שריר חלק בשדה הראייה. לאחר שבחרתם את האתר לצילום, עברו לעדשה בעלת הגדלה גבוהה יותר, כגון 40 x.
סובב את השולחן או את הציר האופטי כך שתא השריר החלק או תאי השריר החלק יהיו במצב אופקי. כלומר, במקביל לציר הסריקה המהירה. תאי השריר החלק מוכנים כעת לדימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מסוג Leica SP two. סגרו את חור הפינהול (pinhole) לרדיוס של דיסקת אוויר אחת (one airy disc). הגדירו את עוצמת הלייזר בין 25% ל-35% במסנן הניתן לכוונון של custo optic.
ערך זה מהווה פשרה בין בהירות לבין פוטו-bleaching. כדי להיערך לניתוח הנתונים, הורד והתקן את ImageJ. הורד את הגרסה המתאימה למערכת ההפעלה ולאחר מכן עדכן לגרסה האחרונה על ידי הורדת קובץ ה-jar העדכני ביותר של ImageJ כדי להחליף את הקובץ הישן. לאחר מכן, הורד את קובץ ה-jar של ה-Excel writer והתקן אותו בספריית ה-plugins jar.
העתיקו את הקבצים הללו לספריית התוספים (plugins). התקינו כל אחד מהסקריפטים הללו באמצעות המאקרו של התוספים. השתמשו בפונקציית ההתקנה של image J. התוכנה עבור מיקרוסקופ הקונפוקאל Leica SP2 שבו אנו משתמשים נקראת Leica.
LCS שומרת פרימות בודדות מכל סדרה כקובץ נפרד. כדי לשחזר את הסדרה, ודאו שכל הפרימות המיועדות לשחזור נמצאות בתיקייה אחת.
לדוגמה, תיקייית נתוני tiffs. לאחר מכן, בחרו במקרו Leica SP two stacker מתוך תפריט ה-plugins macros. בחרו בתיקיית השורש, ובמקרה זה בתיקיית הנתונים.
בחר את התיקייה הרצויה מרשימת הגלילה. במקרה זה, עבור קבצי tiffs, בחר תיקיית פלט או צור תיקייה חדשה. לדוגמה, תיקיית data folder stacks.
הסקריפט ישחזר לאחר מכן סדרות מתוך פריימים בודדים כדי לתקן תזוזות. אנו משתמשים באלגוריתם הזמין בחינם המיישר או מתאים פריימים בתוך סדרת ערימה של הורדות (downloads stack), rig ו-turbo reg. העתיקו את הקבצים עבור כל אחד מהם לתיקיית ה-stacks.
טענו ערימה (stack) לעיבוד ולאחר מכן עברו לפריים המראה בבירור את שדה העניין. פריימים אחרים ייושרו לפי פריים ייחוס זה. לאחר מכן, עברו ל-plugins stacks.
רישום ערימה. נסו כל אחת מהטרנספורמציות השונות כדי לקבוע מהי היעילה ביותר עבור כל אתר. גורמים תמונה המשפיעים על זיהוי מעברים של סידן ישתנו בהתאם למדידה של תכונות מסוימות, פרמטרי חלקיקים של כל אתר.
הרגישות והסגוליות של הזיהוי עולות. לכן, עבור כל אתר, נחשב סף למכסה של סף עבור היחס וסף לקצה התא. כדי להתחיל, עברו ל-plugins, לאחר מכן ל-macros, בחרו ב-install ובחרו ב-jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. לאחר מכן עברו ל-plugins, ל-macros ול-load stack.
בחרו סדרה וחשבו את פרמטרי החלקיקים הבאים. כדי לחשב את סף החיתוך עבור הפחתה (subtracted), בחרו אזור עניין מלבני מעל מה שנראה כרעש הרקע. רשמו את הממוצע. כדי לחשב את סף החיתוך עבור יחס (ratio), בחרו אזור עניין מלבני סביב אזור שטוח מבחינה אופטית של תא או תאי שריר חלק.
מדדו ורשמו את הממוצע וסטיית התקן. חזרו על התהליך פעמיים נוספות, או שתוכלו לשרטט שלושה מלבנים בבת אחת על ידי לחיצה על shift. חשבו ורשמו את סף היחס.
חשב את סטיית התקן חלקי הממוצע פלוס אחד, ולאחר מכן הכפל את התוצאה ב-32. בחישוב ממוצע של ערכים משלוש חזרות, המקדם 32 נחוץ כדי להתחשב באלגוריתם היחס, שבו חוסר שינוי מהפריים הקודם ממופה לערך שלם של 32. דבר זה מספק טווח דינמי טוב לזיהוי עליות וירידות ביחס.
עבור תמונה בעלת שמונה ביטים, בחרו ב-image adjust threshold. בחרו ב-black and white. הגדירו את הגבול העליון של המהלך (upper slide limit) ורשמו את הערך המתאים.
זהו המיקום מימין למכוון. רק אירועים המתרחשים באזורים השחורים ייספרו. לחץ על איפוס.
כעת, לאחר שחושבו סף ההחסרה עבור היחס וסף קצה התא, ניתן לנתח את ערימות התמונות. קבעו את מיקום הערימות המיועדות לניתוח. בשלב זה, בחרו סדרה אחת בלבד.
זהו הקובץ הראשון, והקובץ האחרון צריך להיות זהה. לאחר מכן, בחרו מיקום עבור פלט קבצי הנתונים והמחסניות (stacks). לדוגמה, תיקיית פלט נתונים.
הזינו ערכי סף עבור הסרת הסף (subtracted threshold), סף עבור היחס (ratio threshold) וסף קצוות התא (cell edge threshold). השאירו את שאר ההגדרות בערכי ברירת המחדל שלהן. האלגוריתם ייצור חלון בעל שני פאנלים, שבו הסדרה המעובדת תוצג משמאל והסדרה המקורית מימין.
פתחו קובץ זה מתיקיית הפלט ועברו עליו בקפידה כדי להעריך את מספר התוצאות החיוביות השגויות ואת המקרים שבהם אירועים הנראים לעין לא זוהו. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט מאפיינים של האירוע שזוהה, כגון אמפליטודה, שטח ומיקום; תוצאות חיוביות שגויות שזוהו באמצעות סקירת קובצי התמונה שייצאו מהאלגוריתם ניתנות להסרה ידנית מקובץ Excel זה. עם זאת, עליכם להגדיר קריטריונים מחמירים לביצוע פעולה זו.
זהו סרטון של תנודות סידן בשריר חלק. בדוגמה זו, הסרטון מורכב מ-100 פריימים בודדים שנרכשו בשיעור של חמישה הרץ. אנו נרכוש סרטונים רבים own מהסוג הזה לכל ניסוי כאשר אנו חוקרים, למשל, את ההשפעה של תרופה מסוימת על תדירות תנודות הסידן.
כאן אנו רואים מספר רב של תנודות סידן ספונטניות בתאי השריר החלק. תוצאת אלגוריתם זיהוי החלקיקים מוצגת כאן. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט מאפיינים של האירוע שזוהה, כגון אמפליטודה, שטח ומיקום.
הדגמנו שיטה לדימוי מעברי סידן באיברים בעלי שריר חלק, כגון שלפוחית השתן, והראינו דרך לניתוח מעברי סידן אלו באמצעות אלגוריתם שפיתחנו במעבדה. הדברים החשובים שדורשים התייחסות הם הכנה נאותה של הרקמה לדימוי הסידן. במקרה של הרקמה שהדגמנו היום, הכנה זו כוללת הסרה של רקמת חיבור והסרה של כל שומן שעלול להסתיר את שדה הראייה.
חשוב גם להקבע את הרקמה כגיליא שטוח. ובכן, בהצלחה בניסויים שלכם ותודה שצפיתם.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט שיטות לדימות Ca2+ ברזולוציה גבוהה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים. הוא עוסק בהכנת רקמות, ברכישת תמונות ובניתוח נתונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- דימות סידן הוא חיוני להבנת תפקוד השריר החלק.
- הוא מאפשר לחוקרים ללמוד על שחרור מתווכי חוליה עצבית והשפעותיהם.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה משפרות את דיוק הנתונים.
- הכנות של איברים מבודדים מספקות תנאים ניסיוניים מבוקרים.
מטרת המחקר
- להדגים טכניקה של דימות סידן בשריר חלק.
- לנתח את השפעותיהם של מוליכים עצביים על פעילות השריר החלק.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- הכנת תמיסת טעינה של סידן.
- דיסקציה והכנה של רקמת שריר חלק.
- טעינה ודגירה של אינדיקטור לסידן.
- טכניקות מיקרוסקופיה לדימוג וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- טעינה מוצלחת של אינדיקטורים לסידן ברקמת שריר חלק.
- דמויות ברזולוציה גבוהה שצולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- ניתוח הנתונים חשף אירועי איתות סידן משמעותיים.
- הפרוטוקול תוקף לשימוש במחקרים נוספים של פיזיולוגיה של השריר החלק.
מסקנות
- השיטות המתוארות מאפשרות מחקר מפורט של תפקוד השריר החלק.
- דימוי סידן יעיל לניתוח השפעות של מוליכים עצביים.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה לרקמות שריר חלק שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
שיטה זו מאפשרת זיהוי ברזולוציה גבוהה של מעברים קצרים (transients) מוקדיים של Ca2+ בשריר חלק, ומספקת קריאה אופטית ישירה של שחרור מוליכים עצביים מעצבים אוטונומיים. על ידי לכידה של אירועי Ca2+ תת-תאיים בדיוק מרחבי-זמני, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות עבור מודולטורים של GPCR ותעלות יונים המשפיעים על השריר הדטרוסור, צינור הד deferens ורקמות סינציטליות אחרות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור סיגנל פורינרגי לתגובות רקמתיות תפקודיות, ללא הסתמכות על אלקטרופיזיולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני שחרור מוליכים עצביים פורנינרגיים באמצעות זיהוי רגעי של Ca2+ מקומי בשריר חלק.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של רספטורי P2X1 ומסלולי איתות פורנינרגיים קשורים ברקמה רלוונטית למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור מעורבות ליגנד-רספטור לאיתות Ca2+ במורד המסלול בהקשר של רקמה טבעית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים (תדירות, מיקום, אמפליטודה) של תנודות Ca2+ לצורך אפיון השפעת תרכובות.
- שחזוריות: משתמש ביישור תמונות אוטומטי ובזיהוי מבוסס סף כדי למזער שונות בין מפגשי הדמיה.
- יכולת הרחבה: מאפשר ניטור סימולטני של מספר אתרי שחרור בשדה ראייה אחד, ובכך מגביר את התפוקה להערכת פעילות ספציפית לאתר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל סיגנלינג נוירו-אפקטורי במערכת השתן התחתונה וברקמות רבייתיות, שבהן קוטרנסמיסיה פורינית מווסתת את כושר התכווצות השריר.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין אירועי שחרור מ neurotransmitter אקוטיים לבין תגובות תפקודיות של רקמות במודלים פרה-קליניים של שלפוחית שתן פעילה יתר ומחלות מוטיליות.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות go/no-go על ידי כימות תדירות הטרנזיאנטים של Ca2+ המושרים על ידי אגוניסט, כסמן ביולוגי למעורבות של המסלול.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות המטרה ועד לתיקוף תפקודי ברקמה טבעית, ובמיוחד עבור מווסתים של מערכת העצבים האוטונומית ותרופיתים המכוונים לשריר חלק.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני שחרור מוליכים עצביים ואותות Ca2+ ספציפיים למסלול ברקמה שלמה.
- סריקה: מאפשרת פיתוח של בדיקות לזיהוי השפעות של תרכובות על פרמטרים של מעברים זמניים של Ca2+, ספונטניים ומעוררים.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות (אמפליטודה, שטח, מיקום) המאפשרות השוואה בין תנאים ניסיוניים לבין יעילות התרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין טרגט מולקולרי לתוצאות תפקודיות ברמת הרקמה בהכנות של שריר חלק הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לדימוי ואנליזה לצורך חקר תמסורת נוירו-אפקטורית במספר מיטות של שריר חלק.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בצימוד שבין מוליכים עצביים לשריר חלק, על ידי אספקת ראיות אופטיות ישירות למקורם של תהליכי Ca2+ חולפים (transients).
- ערך תפעולי: מספק גילוי סטנדרטי ו可שחזור של אירועי Ca2+ סטוכסטיים באמצעות סף אלגוריתמי ויישור פריימים.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי קישור מודולציה של המטרה לאירועי איתות מדידים ברמת הרקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות בהתאם לסיכון, בהסתמך על יעילותן בהשראת או עיכוב של תהליכי Ca2+ פורינרגיים חולפים.
שיקולי יישום
- מומחיות בטעינה של אינדיקטורים ל-Ca2+, בדיסקציה של רקמות ובהגדרת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
- גישה למיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר ובקרת סביבה עבור פרפוזיה של רקמות.
- סטנדרטיזציה של תהליכי ניתוח תמונות, כולל חיסור רקע, תיקון תנועה וכיול סף (threshold).
- שיקולי התאמה עבור סוגים שונים של שריר חלק (למשל, צינור הד deferredens, עורק) בהתבסס על עובי הרקמה וקינטיקת הטעינה.
- מגבלה: תדירות אירועים חולפים ספונטניים עשויה לדרוש ייצוב של קו הבסיס ונורמליזציה של השפעת התרופה.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Introduction
1:30
Preparing the Ca2+ Indicator, Dissecting the Tissue, and Loading the Ca2+ Indicator
5:05
Preparing the 'Ca2+ Loaded' Tissue for Microscopy
8:44
Preparing for Analysis and Correcting for Movement
11:57
Particle Detection Algorithm
16:53
Conclusion
