הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS
2 ביולי 2009
Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.
בפרוטוקול וידאו זה, תראו כיצד לבצע דיסוציאציה של רקמת ריאה מעכבר בוגר באמצעות gentle max לאחר פירוק רקמת הריאה. בנוכחות collagenase d ו-DNAS one, סספנסיות של תאים מסוננות באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרון, עוברות צנטריפוגציה ומושעות עבור יישומים המשכיים. שלום, אני מלני מלו מ-Mil Biotech בגרמניה.
היום אדגים לכם פרוצדורה אוטומטית וניתנת לשחזור להכנת תרחיף של תאים בודדים מרקמת ריאה של עכבר באמצעות שימוש ב-GenX dissociation. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי להכין תרחיפים של תאים בודדים לצורך בידוד של לוקוציטים או תאים אנדותליאליים. אשרינו, בואו נתחיל.
לפני תחילת הפרוטוקול, יש להכין ולהכין מספר תמיסות סטנדרטיות. ראשית, נזדקק לבuffer Hebes. שנית, תמיסת collagenase D המכילה 100 mg/mL אנזים ו-buffer Hebes.
שלישית, תמיסתו של dase one המכילה 20,000 units per milliliter של dase one. לבסוף, שתי תמיסות בופר נפוצות: בופר PBS טיפוסי ב-pH 7.2 ובופר PEB המופק מתמיסת שטיפה AutoMax ומסמיס BSA.
נפתח את הפרוטוקול עם ריאה מנותחת שהופקה מעכבר ביופסיה נקבה בן שש עד שבעה שבועות. ודאו שהריאה נקייה מאיברים סמוכים כגון הלב והתימוס, כלי דם יוצאים ונכנסים, קנה הנשימה ורקמות חיבור. שטפו את הרקמה בצלחית פטרי המכילה PBS כדי להסיר אריתרוציטים.
בדרך כלל, ריאה של עכבר בגיל זה שוקלת בין 110 ל-150 מיליגרם. אם אתם מתכננים לבצע דיסוציאציה לריאות מבעלי חיים מבוגרים יותר או מזני עכברים אחרים, שקלו את הרקמה ואת הבופר. ניתן לבצע דיסוציאציה למקסימום 450 מיליגרם רקמה לכל מבחנה אחת.
העבירו את רקמת הריאה למבחנת gentle max C המכילה 4.9 milliliters של heis buffer. הוסיפו 100 microliters של תמיסת collagenase D לריכוז סופי של two milligrams per milliliter לרקמת הריאה ולבופר. כעת הוסיפו 10 microliters dase.
תמיסה אחת ליותר מ-150 מיליגרם רקמה. הוסף 20 מיקרולטר מתמיסה אחת. ודא שצינור C סגור היטב והנח אותו כשהוא הפוך על ה-gentle max dis.
ודאו שהרקמה ממוקמת בין הרוטור לסטטור. בחרו בתוכנית הריאה והפעילו אותה על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה. עם סיום התוכנית, הוציאו את צינור ה-C מהמכשיר והדגרירו את הדגימה למשך 30 דקות.
במהלך הדגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C, יש לסובב את המבחנה באמצעות מסובב המבחנות max mix או לסובב אותה ידנית מדי חמש דקות. לאחר הדגירה, החזירו את מבחנת ה-C למכשיר ה-gentle max Associator והפעילו את תוכנית הריאה השנייה. בזמן ריצת התוכנית, הכינו מבחנה של 50 mL לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת הפקק במסננת תאים בעלת רשת של 70 µm. עם סיום תוכנית הדיסוציאציה, ובהתאם להתפלגות חומר הדגימה במבחנה, ניתן לצנטריפוג את המבחנה לזמן קצר כדי לרכז את חומר הדגימה.
ניתן להוציא את התאים המופרדים מהמבחנה באמצעות פיפטור דרך הפקק האטום ב-C tube. באמצעות טיפ של פיפט 1000 microliter מתאים, מעבירים את תרחיף התאים דרך מסננת תאים כדי להסיר חלקיקים גדולים או אגרגטים. לאחר ניקוז התמיסה, שוטפים את מסננת התאים על ידי הוספת חמישה milliliters נוספים של בופר HBSS בטמפרטורת החדר כדי לרכז את התאים המסוננים.
סבב את המבחנה בנפח 50 milliliter בצנטריפוגה ב-300 GS למשך 10 דקות. כעת שאב את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את משקע התאים בנפח הרצוי של בופר PEB בטמפרטורת החדר.
אין להסיר את הנוזל העלון. ניתן כעת להמשיך ליישום הבא. דיסוציאציה של רקמת ריאה מעכבר באמצעות פרוצדורה זו תניב אחוז גבוה של לוקוציטים ותאי אנדותל חיוניים.
תרחילי התאים הבודדים שהתקבלו נצבעו ב-CD 45 PE, CD 1 46 FITC, או CD 31 FITC, ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. תרשים זה מראה את העשרת התאים הדנדריטיים באמצעות microbeads של CD 11 C, מפריד minimax ושתי עמודי MS. כעת הצגתי בפניכם כיצד להכין תרחילי תאים בודדים מרקמת ריאה של עכבר בדרך סטנדרטית, באמצעות הדיסוציאציה של gentle mix ומבחנות C.
שיטה זו מאפשרת דיסוציאציה יעילה של רקמת ריאה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבצע דיסקציה נכונה של הריאה ולעבד את הרקמה מיד לאחר הדיסקציה. ניתן להשתמש בתרחיפי התאים הבודדים שהוכנו לניסויים נוספים.
לדוגמה, סימון מגנטי של התאים, ולאחר מכן הפרדה של לוקוציטים או תאי אנדותל. אוקיי, זהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מדגים את דיסוציאציית רקמת ריאה מעכבר בוגר באמצעות ה-gentleMACS dissociator. הפרוצדורה נועדה להפיק כמות גדולה של תאים חיוניים הניתנים לתרבית עבור יישומים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- טכניקות לפירוק תאים
- הכנת תרחיף של תאים בודדים
- ניתוח רקמת ריאה של עכבר
רקע
- ניתוק תאים מרקמות דורש פרמטרים ספציפיים.
- מנתק התאים gentleMACS מספק פרוטוקול מותאם.
- Collagenase D ו-DNase משמשים בתהליך הניתוק.
- תרחיפי תאים מסוננים מוכנים ליישומים נוספים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה הניתנת לשחזור להכנת תרחיפי תאים בודדים.
- להקל על חקר לויקוציטים ותאי אנדותל.
- לספק פרוטוקול מעשי לחוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש ב-gentleMACS dissociator לערבוב רקמות.
- החלת collagenase D ו-DNase במהלך הדיסוציאציה.
- סינון של תרחיפי תאים דרך מסננת תאים של 70 micron.
- סנטריפוגציה והשעיה של תאים ליישומים נוספים.
תוצאות עיקריות
- דיסוציאציה מוצלחת של רקמת ריאה מעכבר לתלייה של תאים בודדים.
- השגה של נפח גבוה של תאים חיים הניתנים לתרבית.
- הפרוטוקול הדגים הדירות ויעילות.
- הכנה המתאימה ליישומים המשכיים.
מסקנות
- מכשיר ה-gentleMACS dissociator יעיל לפירוק רקמת ריאה.
- ניתן להחיל שיטה זו על סוגי רקמות שונים.
- מספק כלי בעל ערך לחוקרים הלומדים רקמת ריאה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פירוק רקמה סטנדרטי הוא שלב מקדימ וקריטי במחקר בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה הווסקולרית, המאפשר הכנה הדירה של תרחיפי תאים ראשוניים לצורך ניתוחים המשכיים. ה-gentleMACS Dissociator מספק שיטה אוטומטית, עדינה וניתנת להרחבה ליצירת תרחיפי תאים בודדים עם חיוניות גבוהה מרקמת ריאה של עכבר, ובכך תומך בקבלת קלט עקבי עבור ציטומטריית זרימה, מיון תאים ופרופיל מולקולרי. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרי תיקוף של מטרות על ידי הפחתת השונות בתנובת התאים ובחיוניותם בין ניסויים שונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של אוכלוסיות לוקוציטים ותאי אנדותל ברקמת ריאה לצורך בדיקת השערות מטרות.
- ערך תפעולי: מפחית שונות ידנית בעיבוד רקמות, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות ונקודות זמן שונות.
- ערך חיזוי: תומך בקלט תאי עקבי עבור ציטומטריית זרימה ומיון תאים, ובכך מגביר את הביטחון בתוצאות סריקת פנוטיפים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תרחיפים מסוננים ללא שאריות, המתאימים לצביעה בנוגדנים ולבדיקות מבוססות זרימה.
- ערך תפעולי: עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית סטנדרטיים מבטיחים עקביות בתשואת התאים בין סדרות שונות.
- מוכנות לבדיקה: מייצר תרחיפים התואמים ליישומים המשכיים כגון סימון מגנטי והפרדת תאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר דינמיקה של תאי חיסון ותאי כלי דם ברקמת ריאה.
- תמיכה במודל פרה-קליני: מאפשר בידוד של תאים ראשוניים מריאות עכברים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות.
- קידום מותאם סיכונים: הכנת תאים אמינה תומכת בניתוח עקבי של סמנים ביולוגים ובתיקוף תפקודי בתהליכי עבודה פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מכשיר ה-gentleMACS Dissociator משתלב בזרימת העבודה של הגילוי כשלב סטנדרטי להכנת דגימות בין איסוף הרקמה לניתוח התאי, ומאפשר מעבר אמין מרקמה ex vivo לתאים בודדים המוכנים לבדיקה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבידוד מונחה-השערה של תאי מערכת החיסון ותאי סטרומה השוכנים בריאה לצורך ניתוח מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק תרחיפי תאים הניתנים לשחזור עבור סריקה פנוטיפית של מודולטורים חיסוניים המבוססת על תוכן גבוה או על זרימה.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות כמותיות של ציטומטריית זרימה (למשל, +CD45, +CD31) לצורך השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין מודלים של ריאות עכברים למחקרים של תאי מערכת החיסון ותאים אנדותלייליים רלוונטיים לבני אדם באמצעות הכנה סטנדרטית.
- שימוש חוזר בארגון: הפרוטוקול המתוכנן מראש של המכשיר עבור ריאות מאפשר שימוש חוזר בפרויקטים החוקרים דלקת ריאתית, פיברוזיס או זיהום.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: חיוניות וטוהר גבוהים של לוקוציטים ותאי אנדותל משפרים את איכות הנתונים ביישומים המשכיים.
- ערך תפעולי: אוטומציה מפחיתה את זמן העבודה הידנית ואת השונות התלויה במשתמש בתהליך הדיסוציאציה של הרקמה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על בסיס מדדי חיוניות ותנובה תאית עקביים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומכת בתעדוף מטרות מותאם סיכון על ידי אספקת תאי מקור ראשוניים אמינים לצורך ולידציה.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בדיסקציה אספטית של רקמות וטיפול אנזימטי.
- תלוי בגישה למכשיר gentleMACS Dissociator עם תוכנית ייעודית לריאה ומבחנות C.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוזי האנזימים (Collagenase D, DNase) ותנאי הבאפר בין המשתמשים השונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני עכברים, גילאים או מודלים של מחלות המשפיעים על צפיפות הרקמה.
- מוגבל לרקמות התואמות לדיסוציאציה אנזימטית; ייתכן שיידרשו חלופות מכניות עבור דגימות סיביות או מסוידות.
