אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים
27 ביולי 2009
בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.
הליך זה מתחיל עם קבלת מוח שעבר פרפוזיה ב-4% PFA, הוצאה חיצונית והגנה בקירור (cryoprotection), אשר נשלח ל-Neuroscience associates לצורך הטמעה באמצעות נקודות ייחוס ליישור המוטמעות במטריצה המקיפה. ניתן לחתוך את המוח במישור הקורונלי כדי להפיק חתכים סדרתיים בעובי רצוי, אשר ייצגו את כל ההויעת הקדמית-אחורית של המוח באמצעות סלים ומכלים ייעודיים. ניתן לבצע עיבוד אימונוהיסטוכימי של סדרות (Batch immuno processing) כדי לקבוע את דפוס הביטוי המרחבי של חלבון לאורך המוח כולו.
שלום, אני ד"ר Shaheen Zur ממעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני ד"ר Mark Burke, גם אני ממעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני ד"ר Mo Petto, מנהל מעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה, אוניברסיטת מונטריאול.
היום נדגים לכם פרוצדורה לצביעה אימונוהיסטוכימית של סדרות (batch immuno staining) לצורך זיהוי חלבונים בקנה מידה רחב במוח של קוף שלם. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את דפוסי הביטוי של חלבוני מטרה בכל רחבי המוח, וכדי להשוות ולבחון את הביטוי של חלבונים אלו בתוך אותו מוח. אז בואו נתחיל.
לפני העיבוד ההיסטולוגי, השג מוח של פרימט, שנשמר באמצעות פרפוזיה סיסטמית, קיבוע מאוחר והגנה בקירור (cryoprotection) באמצעות תמיסות סוכרוז בריכוזים מדורגים. בשלב זה, המוח נשלח ל-neuroscience associates לצורך הטמעה וביצוע חיתוכים חופשיים באמצעות הטכנולוגיה הקניינית שלהם. עם החזרת הדגימה, ניתן יהיה להבחין בשבע נקודות ייחוס ליישור שהוצבו במטריצת ההטמעה, כך שניתן יהיה להכווין את החיתוכים כראוי ולהחזירם למקומם לאחר השלמת העיבוד ההיסטולוגי.
במהלך ביצוע החיתוך, מצוללים תמונות דיגיטליות שניתן להשתמש בהן מאוחר יותר לשחזור תלת-ממדי של מפות אנטומיות. עוזר למדען עצבים מעבד את הרקמה שלנו כדי להפיק חיתוכים קורונליים רצופים צפים באופן חופשי בעובי 50 micrometer לאורך כל המוח. עם השלמת התהליך, נוכל להתחיל בעיבוד היסטולוגי של החיתוכים.
כאשר אנו מתחילים בעיבוד היסטולוגי, עלינו לטפל בדרך כלל בכ-140 חתכים עבור כל נוגדן או צבע. כאן נדגים את הטכניקה על מדגם קטן יותר של חתכים שטופלו בנוגדן SMI 32, שהוא נוגדן מונוקלונאלי נגד חלבוני נוירופילמנט שאינם זרחניים. לאורך הפרוצדורה, נעשה שימוש בערכות צביעה ובסלים ייעודיים, המאפשרים עיבוד סימולטני ויעיל של מספר רב של חתכים צפים באופן חופשי.
פעולה זו מבטיחה שהצביעה שתתקבל תהיה עקבית בכל החתכים. השלב הראשון הוא דגירה של החתכים בתמיסה מבוססת PBS המכילה TRITTON X 100 וסרום סוס נורמלי למשך 60 דקות. הדבר יפחית את הקישור הבלתי ספציפי של מולקולות הנוגדן, הגורם לצביעת רקע.
בשלב הבא, מדגגי החיתוכים מודגרו למשך לילה. למחרת, החיתוכים נשטפים במשך שלוש תקופות של 10 דקות בכל אחת בתמיססת שטיפה, ולאחר מכן מודגרו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתמיססת נוגדן ראשוני SMI 32 מבוססת PBS, המועשרת ב-tritton X 100 ובסרום סוס נורמלי, ולאחר מכן בתמיססת נוגדן משני Muse ביוטינילי מבוססת PBS המכילה Triton X 100 וסרום סוס נורמלי.
לאחר סדרה של שלושה שטיפות נוספות למשך 10 דקות, המקטעים מונחים בתמיסה של קומפלקס avadon biotin conjugated horse radish peroxidase למשך שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, לאחר סדרה נוספת של שטיפות, המקטעים מונחים בתגובת D amino benzine למשך 10 דקות, המייצרת צבע חום בתוך הנוירונים בעלי התגובתיות החסונית. התגובה מופסקת לאחר מכן על ידי הוצאת סלסילת הצביעה והטבלת המקטעים ב-PBS.
לאחר שני עד שלושה שטיפות של חמש דקות ב-PBS, הפרוסות מוכנות להרכבה אינדיבידואלית על גלסיידים כדי להתחיל את תהליך ההרכבה באמצעות צלחת פטרי גדולה ומכחולי צבע רכים מאוד. הפרוסות מורמות ממיכל תמי विलयן ה-PBS ומוצמדות בנפרד לגלסיידים מצופים בג'לטין. לאחר מכן, הדגימות מותירות להתייבש באוויר למשך הלילה בתוך מapay fume hood למחרת.
שוטפים את החתכים על ידי טבילה במים דה-יוניים כדי להסיר גבישי מלח שעלולים להישאר מתהליך ההטמעה. לאחר מכן, מייבשים את השקופיות בשלבים מדורגים של אתנול, מנקים ב-xylene ומכסים בכיסוי זכוכית עם תסבוב Permount. בשלב זה, יש לאחסן את השקופיות למשך כשבוע עד 10 ימים במצב אופקי כדי לאפשר לתסבוב להתקשות.
לאחר מכן, ניתן לאחסן את הפלטים בקופסת פלטים או להעבירם לדימוי באמצעות מיקרוסקופיה. שיטה זו מייצרת פרופיל ביטוי מלא של חלבון מטרה רצוי לאורך מוח קוף שלם. כאן אנו מציגים חתכים קורונליים מייצגים המספקים תמומי מצב של ביטוי FMRP, new n ו-SMI 32.
באותו מוח של קוף. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית במקבץ (batch staining) עבור חלבון מטרה רצוי בכל רחבי המוח. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שכל הנסכים עוברים ערבוב עדין בזמן הדגרה בתמיסות השונות, ושהם נותרים טבולים לחלוטין בכל עת.
בנוסף, הקדישו את הזמן הדרוש בזמן הכנת הדגימות למשטח זכוכית (glass mounting) והסירו כמה שיותר קמטים וקיפולים מבלי לפגוע בשלמות הרקמה. וזהו. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בגישה חדשנית לזיהוי אימונולוגי רחב-היקף של חלבוני מטרה ברחבי מוח הפרימט. הוא מדגיש שיטות חדשניות להטמעה וחיתוך של רקמות, יחד עם טכניקות צביעה במנות למספר רב של חתכים צפים באופן חופשי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- זיהוי אימונולוגי
- דימוי מוחי
רקע
- זיהוי אימונולוגי הוא בעל חשיבות מכרעת לחקר ביטוי חלבונים במוח.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות מוגבלות בהיקפן וביעילותן.
- התקדמות בטכניקות עיבוד רקמות יכולה לשפר את יכולות המחקר.
- עיבוד במנות מאפשר ניתוח מקיף של התפלגות חלבונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטות לזיהוי אימונולוגי בקנה מידה רחב במוחות של פרימטים.
- שיפור היעילות של ניתוח ביטוי חלבונים.
- הקלה על חקר דפוסי ביטוי מרחביים ברחבי המוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרפוזיה של 4% PFA לשימור המוח.
- הטמעה באמצעות נקודות ייחוס ליישור במטריצה היקפית.
- חיתוך במישור הקורונלי לקבלת חתכים סדרתיים.
- עיבוד אימונו-היסטוכימי של קבוצות לדגיון של ניתוח ביטוי חלבונים מרחבי.
תוצאות עיקריות
- הטמעה וחיתוך מוצלחים של רקמת מוח של פרימטים.
- יכולת מוכחת לניתוח דפוסי ביטוי של חלבונים.
- טכניקות חדשניות המשפרות את יעילות הגילוי האימונולוגי.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקרי מדעי המוח.
מסקנות
- השיטות שפותחו משפרות באופן משמעותי זיהוי אימונולוגי בקנה מידה רחב.
- טכניקות אלו עשויות לקדם את הבנתנו לגבי ביטוי חלבונים במוח.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו עבור יישומים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מיפוי ביטוי חלבונים בקנה מידה רחב במוחות של פרימטים תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות למדעי המוח. צביעה אימונוהיסטוכימית במנות (Batch immunostaining) מאפשרת הערכה כמותית הניתנת לשחזור של התפלגות חלבונים מרחבית בכל רחבי המוח, ובכך משפרת את הביטחון החזוי במעורבות המטרה ובביצוע מודולציה של מסלולים. גישה זו נותנת מענה לפער קריטי במחקר תרגומי על ידי אספקת נתונים מערכתיים רלוונטיים למחלה לצורך זיהוי מועמדים מובילים (lead identification) והתאמה של מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו and פיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של ביטוי חלבוני המטרה ברחבי מוח הפרימט כולו.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות צביעה אחידה של חתכים סדרתיים להערכה עקבית של מעורבות המטרה.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתוני ביטוי חלבונים ברזולוציה מרחבית לצורך קבלת החלטות של המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים באמצעות עיבוד באצוות של חתכים צפים.
- ערך תפעולי: מענה לסטנדרטיזציה של בדיקות וליכולת שחזור באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית מסונכרנת של סטים גדולים של חתכים.
- ערך אסטרטגי: הדגשת המוכנות לסריקה ושימוש חוזר בפלטפורמה להערכה מהימנה של תרכובות בצינורי גילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות התאמה של דפוסי ביטוי חלבונים למודלים של הפרעות נוירולוגיות.
- ערך תפעולי: מתאר את הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פרוטוקולי צביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטיים.
- ערך ניבוי: עוסק בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אפשור מדידה כמותית של רמות חלבונים ואוכלוסיות נוירונליות.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה ועד למחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח ביטוי חלבונים ברזולוציה מרחבית במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות מיפוי חלבונים של המוח כולו.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה ואת השחזוריות שלה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של סדרת חתכים.
- אנליטיקה: מדגיש קריאות כמותיות, כגון רמות חלבון ומספרי אוכלוסיות נוירונים, לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית באמצעות התאמת תבניות ביטוי למחקרי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לזיהוי חלבונים בקנה מידה רחב על פני יעדים ומחקרים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזואי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית במחקרי ביטוי חלבונים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של תהליכי עבודה לצביעה אימונוהיסטוכימית עבור מערכי חתכים גדולים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על פרופילי ביטוי של המוח כולו.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בהיסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה ונוירו-אנ 여기서נומיה.
- דרישות לתשתית מכשירים וניתוח, כולל כלי צביעה ייעודיים, סלסלאות ומערכות מיקרוסקופיה.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור יישור חתכים, עקביות בצביעה ופירוש נתונים.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, ובמיוחד עבור עיבוד מוח של פרימטים לעומת מכרסמים.
- מגבלות מעשיות, כולל מורכבות הטיפול בחתכים ודיוק ההרכבה עבור סדרות חתכים רחבות היקף.
