Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

הליך זה מתחיל באיסוף עוברים מלוחות מיץ ענבים טריים לאחר 30 עד 60 דקות. לאחר הוצאת הלוח מכלוב האגם, אספו את העוברים בעזרת מברשת לחה והניחו אותם על סרט דביק כפול. גלגלו בעדינות עובר אחד על הסרט באמצעות חצי מפינצטה עד לפריצת הקוריון.

הרימו את העובר והניחו אותו בעדינות על כיסוי הזריקה. החליקו מעליו שכבה של דבק het. חזרו על פעולה זו עד שיהיו בידיכם מספיק עוברים.

לאחר הדהידרציה, העוברים מוכנים להזרקה. שלום, אני אינגריד ברוס מושר מהמעבדה של ד"ר Jonathan Sculley במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה מיקרוסקופית לעוברים סינציטליים של דרוסופילה.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את תפקידם של המיקרוטובולים ומנועים מבוססי קינזין במטוזה. לדוגמה, אנו מזריקים במיקרו-הזרקה נוגדנים או מעכבים אחרים של חלבונים מיטוטיים ספציפיים. באמצעות ניתוח השפעת המעכב על המיטוזה, אנו יכולים לקבוע את תפקוד חלבוני המטרה.

אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בהכנות יומיים עד שלושה ימים לפני הניסוי, הכינו את כלוב ההטלה על ידי חיתוך שני חורים קטנים של כסנטימטר רבוע בצדדים מנוגדים של בקבוק פלסטיק. מלאו את החורים בפיסת צמר גפן, באופן המאפשר זרימת אוויר.

הקישו את הזבובים לתוך הבקבוק ולאחר מכן כסו אותו עם פלטת מיץ ענבים. עבור שמרים, שמרו את כלוב הרגליים בטמפרטורת החדר; הזבובים יטילו ביצים למשך עד 10 ימים, לפחות יום אחד לפני הניסוי. שלפו מחטים להזרקה ושמרו אותן בטמפרטורה של 4 °C.

ביום הניסוי, יש להכין ולהטעין את המחטים. ראשית, הוציאו את ה-tubulin המסומן מהמקפיא והניחו אותו על קרח למשך חמש עד 15 דקות. לאחר מכן, דללו אותו עם GPEM buffer וסובבו אותו בצנטריפוגה למשך 10 עד 15 דקות במהירות של 13,000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לבסוף, טענו מיקרוליטר אחד עד שניים למחט ושמרו אותה בטמפרטורה של 4 °C, כדי למנוע פולימריזציה במחט שנגרמת מהטמפרטורה. לפני התקנת לבי 유리 (cover slip), הכינו דבק הפטאן על ידי גלגול סרט דביק דו-צדדי והנחתו בבקבוק של 100 mL.

הוסיפו כ-50 milliliters של heptane, אטמו את הבקבוק ונערנו אותו בעדינות במשך מספר ימים. לפני הכנת העוברים, הכינו תא דהידרציה שבו ימוצבו העוברים לפני ההזרקה. לשם כך, הניחו צלחת של 35 millimeter בתוך Petri dish של 100 millimeter כדי ליצור מעין שולחן, והוסיפו סביבו חומר מייבש, שהוא anhydrous calcium sulfate, כך שגובה החומר המייבש לא יעלה על גובה השולחן, וכסו את המכל.

כדי להתחיל בהכנת העוברים, ראשית, אספו אותם מכלוב האגם על ידי החלפת פלטת מיץ הענבים עם השמרים מדי שעה; יש לצלם את העוברים כשעתיים לאחר תחילת האיסוף. להכנת הזכוכית למחסה, הניחו אותה על צד אחד של זכוכית מיקרוסקופ, והדביקו את ארבע הפינות בעזרת סרט דביק כדי למנוע תזוזה. בעזרת מקלוני צמר גפן, מרחו שכבה אחת של דבק heptane בקו על גבי הזכוכית למחסה.

הדבק לא צריך להיות צמיגי ועליו להתייבש תוך שניות ספורות. אם הוא סמיך מדי, יש להוסיף heptane. לבסוף, הצמד פיסת סרט דביק דו-צדדי לשקף לצד כיסוי הזכוכית.

החלק בעזרת מברשת לחה. הרם בזהירות את העוברים ממעטחת מיץ הענבים והנח אותם על הסרט הדביק הדו-צדדי שעל הזכוכית. לאחר מכן, השתמש בחצי של פינצטה כדי לגלגל את העוברים על הסרט הדביק עד לפריצת הקוריון.

הרימו את העובר על ידי גלגול עדין שלו על פני ה-Corian כך שיידבק לפינצטה, והניחו אותו על דבק ההפטאן שעל הזכוכית של מכסה המבחנה. החליקו את העובר כך שהצד הארוך שלו יהיה מקביל לצד הארוך של הזכוכית. הניחו 10 עד 20 עוברים בשורה אחת.

הסיר את מכסיות הזכוכית והנח אותה בתא דהידרציה למשך שלוש עד שמונה דקות. הזמן תלוי בלחות המקומית ובכמות להזרקה. לאחר מכן, הנח את מכסיות הזכוכית על תא מתכת עם גריז ואקום.

לבסוף, כסו את העוברים בשמן הלוקארבון (halocarbon oil) כדי למנוע התייבשות נוספת. העוברים מוכנים כעת להזרקה. ראשית, אתרו את העוברים תחת עדשה של 16x.

הרחיקו את העוברים ואתרו את המחט מבלי לשנות את מישור המיקוד. מרכזו את המחט והניעו אותה כלפי מעלה מבלי להזיזה בציר ה-X או ה-Y. כדי לפתוח את המחט, הניחו את קצה זכוכית הכיסוי בתוך שדה הראייה, אך לא במיקום שבו תהיה המחט.

הנמיקו את המחט לאותו מישור מוקד. הזיזו בזהירות רבה את זכוכית הכיסוי עד שתפגע במחט ותשבור אותה בעדינות. הרימו את המחט למעלה.

כעת הגבירו את העוברים לשדה הראייה. הורידו את המחט אל תוך השמן, וודאו שמתקבלים טיפות נוזל יפות מקצה המחט. העבירו את העובר ביציבות לעבר המחט, הזריקו טיפה לתוך העובר, ולאחר מכן הרחיקו את העובר.

לאחר שכל העוברים הוזרקו, הם מוכנים לתצפית במיקרוסקופ קונפוקאלי עם עדשה של 60 או 100 x. עובר ביקורת אמור להיראות כמו זה שבסרטון זה. זהו עובר המבטא GFP tubulin ו-RFP histone, שצולם בעדשה של 100 x במיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג spinning disc.

הזמן הכולל המוצג הוא שמונה דקות. גרפים של המרחק מקוטב לקוטב הם בעלי הדירות גבוהה ומהווים מדד אמין להצלחה בעוברים של קבוצת הביקורת. עליהם להיראות כפי שמוצג כאן עבור מחזורים 11 עד 13.

בסרטון זה מוצג עובר ביקורת נוסף. עובר זה מבטא KLP 61 FGFP והוזרק עם r Domine tubulin. גם תמונה זו צולמה באמצעות עדשה פי 100 במיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקה מסתובבת (spinning disc confocal), והזמן הכולל הוא שבע דקות.

סרטון זה הוקלט מיד לאחר מיקרו-הזרקה, והמדרג בריכוז של r Domine tubulin נראה בבירור בתחילת הסרטון. ניתן להשתמש בעובריים אלה כדי לחקור את עיכובו של Klp 61 F לאחר מיקרו-הזרקה של נוגדן ל-Klp 61 F. ניתן לראות את אובדנו של Klp 61 FGFP מהכישורים.

הרגע הדגמנו כיצד לבצע מיקרו-הזרקה לעוברי דרוסופילה בשלב החיתוך. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע בקרות, להתאמן תחילה על הזרקה של בופר או רוטין לבדם, ולוודא שהמיטוזה נמשכת כסדרה דרך השלב התאי. ברגע שכל ההזרקות שלכם יהיו אמינות ולא יגרמו לנזק, תוכלו להזריק מעכב ולבחון את ההשפעה של עיכוב ספציפי זה.

זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.