שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

שלום, אני ברוס דרייפר מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס, ואני ססיליה מואנס מהחטיבה למדעים בסיסיים במרכז לסרטן פרד האצ'ינסון בסיאטל. היום, ססיליה ואני נדגים את הפרוטוקול לשימור בהקפאה (קריו-שימור) של זרע דג זברה, המהווה שינוי של הפרוטוקול המקורי של בריאן הארווי. נראה לכם כי בעבודה בצוותים של שניים, ניתן לבצע קריו-שימור לזרע מ-100 זכרים בודדים בפחות משעתיים.

בעוד שקיים טווח רחב של פוריות לאחר ההפשרה, בממוצע אנו מקבלים פוריות של 25%, וזאת מספרייה שנשמרה בהקפאה למשך למעלה משבע שנים. לכן, בואו נתחיל. לפני ביצוע הליך זה, הכינו תחילה את תמיסות הקפאת הזרע.

מכינים תמיסת Ginsburg Fish ringer טרייה מדי שלושה ימים, ואת תמיסת ההקפאה מכינים מדי יום, עם ובלי מתנול. את הרכבן של תמיסות אלו ניתן למצוא במידע המשלים המקוון המצורף לפרוטוקול זה. החומרים המשמשים בהליך זה עשויים להשפיע על קצב ההקפאה וההפשרה, אשר בתורם עשויים להשפיע על פוריות הזרע שהוקפא.

מסיבה זו, רשימה של חומרים מומלצים מסופקת גם כמידע מקוון משלים. מומלץ להקפיא את הזרע על קרח יבש גרוס דק, בניגוד לגרגרי קרח יבש. דרך פשוטה אחת לגרס קרח יבש היא לעטוף אותו במגבת ולרסק אותו בעזרת פטיש.

שיטה יעילה יותר היא שימוש במטחנה של קרח יבש, כגון דגם Claws RE two, להקפאת זרע של דגי זברה. ראשית, סמנו צינוריות נימיות של 10 µL באמצעות טוש למעבדה בגובה של 3.33 µL, או כ-16.7 mm מהתחתית. כדי להרדימ את הזכרים, מקמו שני עד ארבעה זכרים בכלי כימי המכיל תמיסת Tricaine מדוללת במי דגים. את המתכון ניתן למצוא בספר דג הזברה.

לאחר ההרדמה, הסירו את הדגים מהחומר המרדים בעזרת כף פלסטיק וייבשו אותם בעדינות בעזרת נייר סופג. שימו דגש מיוחד על ייבוש הצד הוונטרלי. מים מפעילים את תאי הזרה, ולכן קריטי לייבש היטב את האזור שסביב ה-ika.

הניחו את הדג על מחזיק הספוג כאשר הצד הגחוני (ventral side) פונה כלפי מעלה. אם האזור שסביב הסנפירים הבטניים עדיין לח, ייבשו אותו בעדינות בעזרת נייר ניגוב מסוג Kim wipe. הכניסו את צינור הנימי המסומן למתאם פיית גומי למשאבה, המצורף לצינורות הנימיים.

המתאם הוא צינור גומי שקציו האחד כולל פיה והקצה השני כולל מחזיק לקפילריה. לחלופין, ניתן לחבר את צינור הקפילריה למזרק המילטון של 50 µL. בעזרת קטע קצר של צינור טיגון (tigon tubing) בקוטר המתאים, מקמו את הזכר תחת המיקרוסקופ וחשפו את פתח המערכת השתןית-מין על ידי הרחקה זהירה של סנפירי האגן.

בעזרת קצה צינור הנימי, הוצא את הזרע על ידי החלקות עדינות של דפנות הדג באמצעות פינצטה חלקה, או על ידי לחיצה עדינה על דפנות הדג עם האגודל והאצבע; אסוף את הזרע לתוך צינור נימי בעת פליטתו באמצעות שאיבה עדינה. הימנע מצואה שעלולה להיפלט יחד עם הזרע. נפח הזרע המיועד הוא 3.3 µL.

הכמות המינימלית המקובלה של זרע משתנה בהתאם לאיכותו של הזרע. זרע איכותי הוא לבן ואטום, בעוד שזרע דליל נראה מימי. באופן כללי, הכמות המינימלית המקובלה של זרע היא 1 µL של זרע איכותי או שליש מהיעד, ו-2 µL של זרע דליל או שני שלישים מהיעד.

אם נפח הזרע אינו מגיע לנפח המטרה של 3.3 microliters, יש לנרמל את הנפח עד לסימון העט באמצעות מדיום הקפאה ללא methanol. אם נפח הזרע כבר מגיע לסימון העט על צינור הנימי או עולה ממנו, עברו לשלב הבא. כעת הוסיפו את הקריו-פרוטקטור לזרע.

שאבו את מדיום ההקפאה עם המתנול עד לסימון הכתום. הנפח הכולל המשוער הוא כעת 20 microliters. העבירו את תערובת הזרע והקריו-פרוטקטור לאזור נקי של זכוכית שעון, וערבבו בעדינות על ידי שאיבה והנפקה עם הפספט כארבע פעמים, תוך הימנעות מהכנסת בועות.

חלק את הזרע לשתי מבחנות קריו באמצעות פפיטציה של 10 µL של תמיסת הגנה לקריו-שימור של זרע לתחתית כל מבחנה מסומנת. סגור במהירות את מכסי המבחנות והנח כל מבחנת קריו בתוך מבחנת פלקון של 15 mL נפרדת. בטמפרטורת החדר, סגור את מכסי מבחנות הפלקון והכנס אותן לתוך קרח יבש דק.

יש להחדיר את המבחנות לעומק מספיק כדי שרק הפקקים יבלטו, לצורך מעקב אחר מבחנות הפלקון. יש למספר אותן ולתעד את השעה שבה כל מבחנה הוכנסה למקרר הקרח היבש. יש להמתין 20 דקות להקפאת הזרע בקרח היבש.

לאחר הקפאת הזרע, העבירו את שני מבחנות הקריו (cryo vials) אל בקבוק דואר (doer flask) המכיל חנקן נוזלי. לאחסון זמני. הניחו את קופסת ההקפאה באמבט חנקן נוזלי כדי למנוע מהדגימות להתחמם.

השתמשו במלקחי מתכת ארוכים כדי להוציא את המבחנות מבקבוק הדואר וטפלו בהן באמצעות כפפות קריוגניות. לחלופין, ניתן להעביר את מבחנות הקריו ישירות מהקרח היבש למקפיא. אם קופסת המקפיא נשמרת טבולה בחנקן נוזלי בתוך מיכל פוליסטירן לאחסון לטווח ארוך, הניחו את מבחנות הקריו במקפיא חנקן נוזלי קריוגני.

על מנת לשמור על חיוניותם של תאי הזרע, חיוני שהמבחנות יאוחסנו כשהן טבולות בחנקן נוזלי; מבחנות המאוחסנות בשלב האדים עלולות לאבד מחיוניותן עם הזמן. מהירות הפעולה היא קריטית אף היא לשמירה על חיוניות הזרע. הזמן שחולף בין הוספת חומר ההגנה מהקפאה (cryoprotectant) לבין הנחת מבחנות הזרע על קרח יבש לא יעלה על 30 שניות בהפריה חוץ גופית (In vitro fertilization).

שימוש בזרע המשומר בהקפאה עובד בצורה הטובה ביותר עם שני אנשים. אדם אחד סוחט ביצים מהנקבות בעוד שהשני מפשיר את הזרע. הגדירו אמבט מים ל-33 °C.

הוציאו מבחנה קריוגנית ממקפיא החנקן הנוזלי והעבירו אותה למכל או לבקבוק המכיל חנקן נוזלי עד למועד ההפשרה. סגננו ביצים מנקבות שהורדמו לתוך פטריה מפלסטיק בקוטר 35 מילימטר. תהליך זה מתואר בפירוט בפרוטוקול JoVE שכותרתו Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, המספק תיאור מפורט של דגי זברפיש.

בהפריה חוץ גופית (In vitro fertilization), מקבץ ביצים טוב מכיל יותר מ-150 ביצים שהן אחידות ובעלות גוון צהבהב. כל שיירי פספת לבנים מעידים על דגרדציה. במידת האפשר, נסו להשיג שלושה מקבצי ביצים ולאחד אותם לכלי אחד.

אם לא התקבלו שלוש קבוצות תאים איכותיות תוך דקה מרגע קבלת הקבוצה הראשונה, יש להמשיך לשלב הבא. יש להשאיר את הצלחת מכוסה בזמן הפשרת הזרע. בינתיים, הוצא את המבחנה מהחנקן הנוזלי והסר את הפקק.

טבלו במהירות את המבחנה עד מחציתה במקלח מים בטמפרטורה של 33 °C למשך שמונה עד 10 שניות. הוסיפו במהירות 70 µL של תמיסת מלח buffered של Hank's בטמפרטורת החדר למבחנה וערבבו באמצעות פיפוט מעלה ומטה; הוסיפו מיד לביצים בצלחת הפטרי וערבבו בעדינות עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, הפעילו מיד את תאי הזרע והביצים על ידי הוספת 750 µL של מי דגים, סובבו לערבוב והדגרירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות, מלאו את הצלחת בדגים ובמים, והדגירו בטמפרטורה של 28 °C. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, ספרו והעבירו עוברים חיוניים לצלחות של 100 millimeter, בקצב של 50 עוברים לצלחת. כמו כן, ספרו את הביצים המופרות כדי שניתן יהיה לקבוע את פוריות דגימת הזרע.

פוריות זרעים היא היחס בין מספר העוברים החיוניים למספר הכולל של הביצים ששימשו להפריה חוץ גופית. ניתן למיין את הביצים בכל זמן בין שעתיים לשש שעות לאחר ההפריה חוץ הגופית. כאשר ניתן להבחין בקלות בין ביצים לא פוריות לעוברים חיוניים, הביצים הלא פוריות נראות שקופות ולא מחולקות.

בבדיקה באמצעות תאורה שבירה (trans illumination) במיקרוסקופ סטריאו, הפוריות הממוצעת של זרע שהקפא בטמפרטורות נמוכות (cryopreserved) משתנה במידה רבה. עם זאת, ניתן להגיע לממוצע פוריות של 25% שנותר יציב לאורך מספר שנים. גרף זה מציג את אחוז הפוריות הממוצע של זרע שהוקפא בין השנים 2001 ל-2003 ונבדק עד לשנת 2008.

הרגע הדגמנו שיטה בעלת תפוקה גבוהה לשימור בהקפאה של זרע דגי Zebrafish. בביצוע פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בכל כלי הפלסטיק והציוד המומלצים, וכן להשתמש בקרח יבש דק וטחון במקום בכדורי קרח יבש. קריטי להשתמש בזרע וביצים באיכות גבוהה מאוד, ובמקרה של הביצים בעת ביצוע ההפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization), לאחר הפשרת הזרע, חשוב להשתמש במספר רב ככל האפשר של ביצים כדי לשפר את מספר העוברים הפורים שתקבלו בסיום התהליך, מה שעשוי לדרוש שלוש עד ארבע נקבות, נכון?

מרכיב מפתח נוסף בפרוטוקול הוא המהירות. השלב מרגע הוצאת הזרע מהזכר ועד להצבתו בקרח היבש לא צריך לארוך יותר מדקה אחת בקירוב. ובכן, אני חושב שזה הכל.

בהצלחה בניסויים שלכם.