העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא
5 בנובמבר 2009
Ultracentrifuge אנליטית (AUC) תא מדגם מחזיקה מדגם חיץ התייחסות במהלך ניסויים חשוף ואקום גבוה ומהירויות הרוטור עד 60,000 סל"ד. וידאו זה יהיה להדגים את תשומת לב קפדנית לכל פרט הכרחי עבור טעינת הרכבה, ויישור של מרכיב זה חשוב מאוד של ניסוי AUC.
שלום, אני אנדראה באלבו. אני עובד בקבוצתו של פיטר שוקס במכוני הבריאות הלאומיים (National Institutes of Health). בסרטון זה, נדגים לכם את הפרוטוקולים שלנו להרכבה, טעינה וכיול הרוטור של תא דגימה עבור עלטרה-צנטריפוגה אנליטית.
בואו נתחיל. אלו הם הרכיבים של תא דגימה עבור עלטרה-צנטריפוגה אנליטית. בתוך בית התא מוערמת לבב (centerpiece) מ-epon של שטח פחם בעל מגזר כפול ברוחב 12 מילימטר, שתהיה דחוסה בין שתי מערכות חלונות. כל מערכת חלונות מורכבת מאטם חלון, דיפון חלון וחלון המוחזק בתוך מחזיק החלון.
חלקי אלו יוחלקו פנימה לתוך בית התא על ידי יישור התעלים שלהם עם הפין שנמצא בתוך גליל הבית, אטם בית, ולאחר מכן טבעת הברגה תסגור את תא הדגימה במומנט פיתול של בין 120 ל-140 inch pounds. לאחר טעינת הדגימה, שני אטמי פקק של בית ואטם פקק של בית יחתמו את חורי הטעינה של התא כדי למנוע ארטיפקטים של סריקה, דליפות ושברים במהלך הניסויים; חיוני שכל הרכיבים יהיו נקיים, יבשים, נטולי אבק ובמצב הטוב ביותר האפשרי, יש לבחון אותם לעיתים קרובות ולהחליפם בעת הצורך. תזדקקו גם לציוד הבא: Analytical ultracentrifuge, רוטור טיטניום עם ארבעה חורים, מאזנ מעבדה, מפתח מומנט עם חיוג קריא ומעמד מומנט, משקולת איזון ומשקולות איזון, מברג שטוח, פינצטה, פיפטור 200 µL המצויד בקצה פיפטה ארוך ומסוגים, כלי יישור וחומר סיכה לציפוי ספין.
אנו מתחילים בבניית תא הדגימה על ידי הרכבת שני מכלולי חלון. ראשית, מקמיים אטם חלון בתחתית מחזיק החלון. לאחר מכן, ממיקמים את דיפון החלון, הנקרא לעיתים גם כרית חלון, בתוך מחזיק החלון כך שפתח הדיפון יהיה ממול לחריץ המפתח של המחזיק בזווית קלה.
לאחר מכן, הניחו את החלון במחזיק, תוך יישור סימן השריטה שעל החלון עם החריץ של מחזיק החלון. לחצו בעדינות על הקצוות החיצוניים משני צדי החלון. כדי להבטיח איטום תקין והידוק מדויק של תא הדגימה, אנו מצפים בשכבה דקה את אטם המארז בטבעת ההברגה.
באמצעות חומר סיכוך לציפוי ספין (spin coat), מרחו כמות קטנה מאוד של חומר סיכוך בין האגודל לאצבע המורה. צפו את ההברגות של טבעת הבורג בשכבה דקה ושקופה של חומר הסיכוך. צפו באופן דומה גם את אטם המעטפת.
נגבו כל חומר סיכה נראה לעין. כדי להתחיל בהרכבת תא הדגימה, החליקו מכלול חלון אחד, כאשר החלון פונה כלפי מעלה לכובדכם, אל תוך בית התא על ידי יישור החריץ עם המפתח של הבית.
יישרו את חריץ המפתח של רכיב המרכז עם מפתח המעטפת והניחו לו להשתוות בעדינות על גבי מכלול החלון בתוך המעטפת. אין להשתמש בשום סוג של כלי כדי לדחוף את רכיב המרכז לתוך מעטפת התא. פעולה זו עלולה לגרום לנזק בלתי הפיך לרכיב המרכז, שיוביל לדליפות בניסויים המאחסנים חומרים.
סובב את מכלול החלון השני כך שהחלון יפנה לעבר מרכז המבנה והרחק ממך. יישר את החריץ עם מפתח המארז והחלק אותו למטה על גבי מרכז המבנה. הנח את אטם המארז למעלה.
לאחר מכן, הרכיבו טבעת הברגה כך שהמילה out תהיה גלויה, באמצעות האצבעות. לאחר מכן, השתמשו בכלי יישור והדקו את טבעת ההברגה ידנית.
לעיתים רכיב המרכז אינו מחליק בקלות לתוך גליל המארז. ניתן קודם כל ליישר אותו, ולאחר מכן להניח מעליו את מכלול החלון השני. הדבר נעשה על ידי הפעלת לחץ עדין כלפי מטה על מכלול החלון.
ניתן להחליק את שניהם לתוך בית התא בו-זמנית. באופן זה, אנו נמנעים מלחיצה ישירה על החלק המרכזי. זהו זמן מתאים לבדוק אם יש בתא אבק, סיבים או טביעות אצבעות.
תוכלו להבחין גם בטבעות ניוטון המעידות על כך שעדיין קיים אוויר בין מרכז התא לחלונות. אלו ייעלמו לאחר הידוק עם טבעת הברגה כאשר המילה out גלויה כלפי מעלה. הכניסו את תא הדגימה עד הסוף לתוך התא.
קולט המומנט של מעמד המומנט. החזק את התא במקומו על ידי הפעלת לחץ קבוע על ידית מעמד המומנט. בתנועה רציפה אחת, הדק את טבעת הבורג למומנט של בין 120 ל-140 inch pounds.
שחררו את ידית מעמד המומנט והוציאו בזהירות את תא הדגימה. אנו טוענים באופן שגרתי נפח של 400 microliters לכל מגזר של מרכז הפרוסה בקוטר 12 millimeter. באמצעות פיפטה של 200 microliter, מקמו את תא הדגימה כך שחורי הטעינה יהיו למעלה והמילה out על טבעת ההברגה תהיה גלויה.
החלק את טיפ הפ pipette עד למחצית גובהו אל תוך מגזר מרכז השמאלי דרך חורי הטעינה, וטפטף לאט 200 microliters של תמיסת ייחוס. חזור על הפעולה פעם אחת לסך הכל 400 microliters תוך שימוש באותו טיפ pipette ובאותה טכניקה, בזהירות ובאיטיות. מלא את מגזר מרכז הימני ב-400 microliters של תמיסת דגימה.
חיוני להתאים את הנפחים של תמיסות הייחוס והדגימה בצורה המדויקת ביותר. התאמה הדוקה של קצה הפיפטה לפיפטה, טעינה וריקון איטיים של התמיסות, הימנעות מכניסת בועות, ושימוש באותו קצה פיפטה עבור שתי התמיסות – כל אלה מסייעים בשמירה על נפחים שווים לצורך איטום התא.
הנח שני אטמי פקקי בית אדומים בצורה הדוקה לתוך כל חור טעינה, וודא שהם ממוקמים בזהירות בין רכיב המרכז לבית האלומיניום. כסה כל חור טעינה בפקק בית והדק ידנית באמצעות מברג שטוח קטן. לפני טעינת הרוטור, וודא שהמשקולת המאזנת והתא שיהיה מולה נמצאים בטווח של 0.5 grams זה מזה במשקלם.
התחילו עם מאזניים מאופסים. ראשית, שקלו תא דגימה שיוצב במיקום ממול למשקולת הפיצוי. אפסו את המאזניים (Tare) כדי להפחית את משקל תא הדגימה.
לאחר מכן שקלו את משקולת האיזון. במקרה זה, משקולת האיזון קלה ב-4.193 גרם מתא הדגימה. בחרו משקולת איזון של ארבעה גרם והבריגו אותה לתוך חור החיבור של משקולת האיזון, תוך וידוא שהיא אינה בולטת מהחלק העליון.
שקלו שוב את משקולת האיזון כדי לוודא שהמשקל הסופי מדויק בטווח של 0.5 גרם. באמצעות רוטור בעל ארבעה חורים, מקמו את משקולת האיזון בעמדה ארבע כך שהחץ הלבן יהיה גלוי ויפנה לכיוון הכוח הצנטריפוגלי. בעזרת כלי יישור, ודאו שהיא דחוסה עד הסוף בתוך הרוטור.
מקמו את תא הדגימה למאזן כך שפקקי המעטפת פונים למרכז הרוטור והמילה out על טבעת ההברגה גלויה. שוב, באמצעות כלי יישור, ודאו שהתא דחוס עד הסוף בתוך הרוטור. התבוננו מלמטה תחת הרוטור.
בצעו יישור פנימי. בעזרת כלי יישור, סמנו את הסימן הקרוב ביותר למרכז הרוטור עם סימן השריטה שעל המשקולת המאזנת. באופן דומה, יישרו את תא הדגימה במיקום שני.
לאחר שכל התאים סודרו, הרוטור מוכן להצבה בתא הצנטריפוגה.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את ההרכבה, הטעינה והיישור של תא דגימה עבור אולטרה-צנטריפוגה אנליטית (AUC), שלבים הקריטיים לביצוע ניסויי AUC. דגש מיוחד ניתן לטיפול נכון ולהכנה מדויקת של רכיבי תא הדגימה כדי להבטיח קבלת תוצאות מדויקות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אולטרה-צנטריפוגה אנליטית
- שיטות ביופיזיקליות
- טכניקות להכנת דגימות
רקע
- תא הדגימה של ה-AUC חיוני לביצוע ניסויים במהירויות סבוב גבוהות.
- הוא מורכב ממספר רכיבים שיש להרכיבם בדיוק רב.
- שמירה על ניקיון ועל יישור נכון היא קריטית כדי למנוע ארטיפקטים ניסויים.
- הבנת תהליך ההרכבה חיונית עבור חוקרים המשתמשים ב-AUC.
מטרת המחקר
- מתן מדריך מפורט להרכבה וטעינה של תא דגימה ל-AUC.
- הדגשת החשיבות של הכנה קפדנית בניסויי AUC.
- הבטחה שחוקרים יוכלו לשחזר את התהליך באופן מדויק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת מכלולי החלונות ומרכז התא בתוך תא הדגימה.
- הפעלת מומנט פיתול להדקה ואבטחה של רכיבי תא הדגימה.
- טעינת תמיסות ייחוס ודגימה אל תוך התא.
- איזון תא הדגימה באמצעות משקולת נגדית לקבלת מדידות מדויקות.
תוצאות עיקריות
- הרכבה מוצלחת של תא הדגימה של ה-AUC כפי שהודגמה בסרטון.
- טכניקות טעינה נכונות מבטיחות מינימום בועות ונפחים שווים.
- התאמות של משקולת האיזון (Counterbalance) הן קריטיות לביצועים מדויקים של הרוטור.
- אינדיקטורים ויזואליים, כגון טבעות ניוטון, מסייעים בהערכת איכות ההרכבה.
מסקנות
- תשומת לב לפרטים בהרכבת תא הדגימה היא חיונית עבור ניסויי AUC.
- מעקב אחר הפרוטוקולים המפורטים יכול להגביר את המהימנות הניסויית.
- מומלץ לבצע תחזוקה ובדיקה סדירה של הרכיבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הרכבה וכיול נכונים של תאי דגימה עבור אולטרה-צנטריפוגה אנליטית הם קריטיים להפקת נתונים ביופיזיקליים מהימנים על גודל חלבונים, צורתם, טוהרם ומצבי אוליגומריזציה שלהם. הכנה קפדנית של תאי הדגימה ממזערת ארטיפקטים ניסיוניים ומבטיחה את שלמות הנתונים לצורך תיקוף מטרות ומחקרים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. הקפדה פרוצדורלית זו תומכת באמינות החיזוי בתהליכי סריקה ואופטימיזציה של מובילים (lead optimization) בשלבים הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר קביעה מדויקת של מצבי אוליגומריזציה של חלבונים ושל אינטראקציות חלבון-חלבון, ובכך מספק מידע ישיר להיפותזות של תיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מספק הערכה של תכונות מקרו-מולקולריות בתמיסה, ללא סימון, תחת תנאים קרובים למצב טבעי.
- ערך חיזוי: מפחית עמימות מכניסטית בהורדת סיכונים של מטרה על ידי אספקת מקדמי שקיעה ופרמטרי צורה כמותיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק נתוני גודל וצורה הידרודינמיים החיוניים לניסוח באפר הבדיקה ולסריקת יציבות.
- ערך תפעולי: מבטיח את שלמות הדגימה ואת המונודיספרסיה (monodispersity), החיוניים לבדיקות ביוכימיות ובדיקות מבוססות תאים הניתנות לשחזור.
- אינטגרציית פלטפורמה: תומך באפיון ביופיזיקלי של מטרות מטוהרות לפני קמפיינים של סריקה בסביבה של תפוקה גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של יצירת קומפלקסים של חלבונים ושינויים קונפורמציונליים הרלוונטיים למנגנוני מחלה.
- ערך תפעולי: תומך בבדיקות עקביות בין מנות (lot-to-lot) של חלבונים רקומביננטיים המשמשים במודלים פרה-קליניים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין אפיון ביופיזי של המטרה לבין בדיקות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
סבב העבודה של תא הדגימה באולטרה-צנטריפוגה אנליטית משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספק נתונים ביופיזיקליים המנחים החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בהתבסס על התנהגות המטרה ויציבותה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי אוליגומריזציה של מטרה ורשתות אינטראקציה, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים ביולוגיים לפני פיתוח הבדיקה.
- סריקה: מבטיחה מונו-דיספרסיה ויציבות של המטרה, מה שמשפיע ישירות על מוכנות הבדיקה ואיכות הנתונים במסעי סריקה.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של מקדם שקיעה ומשקל מולקולרי המאפשרות השוואה בין מצבי חלבון בתנאים משתנים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ביופיזיקה של מטרה מנוקה לבין תיקוף פונקציונלי במודלים פרה-קליניים באמצעות איכות חומרים עקבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לאפיון ביופיזיקלי של מטרות ופרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתכונות המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית ושיפור הקפדנות בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: הכנת דגימות סטנדרטית, הדירות בין הרצות ויכולת הרחבה בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), הפחתת שיעורי כישלון עקב חוסר יציבות של המטרה ושיפור יעילות ההון בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכונים בהתבסס על נתוני הפחתת סיכונים ביו-פיזיקליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות ביופיזיקליות וטיפול מדויק ברכיבים אופטיים.
- תלוי במכשור של ultracentrifuge אנליטי, מפתחות מומנט, כלי יישור וטיפול בדגימות התואם לחדר נקי.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ניקוי, הרכבה ויישום מומנט.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי דגימות שונים, תנאי בופר וגיאומטריות שונות של ה-centerpiece.
- מוגבל על ידי שבירות הרכיבים; חלונות ו-centerpieces רגישים לנזקים מחלקיקים, מומנט לא תקין או חוסר יישור.
