אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

כדי לחקור את הדינמיקה של מולקולות בודדות לאורך פרק זמן ממושך, יש תחילה למקם את המולקולות במרחב. אנו משיגים זאת על ידי קיבוען על פני השטח של תא מיקרופלואידי. ההליך מתחיל בהרכבת התא, המכיל ארבע תאים שבהם יקובעו הביומולקולות.

התאים מחוברים לחלק החיצוני באמצעות קפילרות כניסה ויציאה. התא מיוצר על ידי היתוך של דיסկ PDMS בעל תבנית לזכוכית כיסוי מסוג קוורץ. התא המורכב מורכב לאחר מכן על מיקרוסקופ פלואורסצנציה, וצינורות גמישים מחוברים לקפילרות כדי לאפשר החלפה קלה של תמיסות דרך התאים; כדי להפעיל את הפני השטח עבור קיבוע של מולקולות, זרימה ראשונה של תמיסת BSA ביוטינילי מועברת דרך אחד התעלות.

BSA ייספח לתא. לאחר מכן, זרימה של תמיסת streptavidin על פני השטח תגרום לקשירתה לביוטין. לבסוף, העבר זרימה של האוליגונוקלאוטיד הביוטינילי, שייקשר ל-streptavidin, ובכך יעגן את המולקולה הנחקרת לפני השטח של כיסוי הקוורץ.

במהלך כל תקופת הרכישה, מזרם קבוע של בופר דימוי שנועד למקסם את יציבות אורך החיים ואת העוצמה של הפלואורופורים, זורם דרך התא. המערך האוטומטי סורק מקטעים שונים של הפני השטח כדי לאתר מולקולות בעלות פלואורופורי תורם ומקבל כאחד, ולאחר מכן מעביר אותן אחת אחת אל נפח הבדיקה, תוך השגת עקבה של עוצמת פלואורסצנציה לאורך זמן עבור כל אחת מהן, עד להפוטו-بلیצ'ינג של שני הפלואורופורים. שלום, אני ניקולס דפי מהמעבדה של פרופסור מילר במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת בוסטון.

היום נדגים לכם הליך להשגת עקומות F של מולקולה בודדת מחומצות גרעיניות מקובעות באמצעות מערכת קונפוקלית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור דינמיקה של חומצות גרעיניות ואינטראקציות בין חומצות גרעיניות לאנזימים. אז בואו נתחיל.

את ה-Microfluid Excel מייצרים על ידי היתוך של דיסק פולי-דימეთיל-סילוקסאן (PDMS) בעובי שני מילימטרים בעל תבנית למשטח כיסוי של קוורץ שנקי טרי. כדי להכין את דיסק ה-PDMS בעל התבנית, ערבבו היטב 10 חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון עם חלק אחד של חומר מעקש (curing agent) ובצעו Degas למשך שעה בוואקום. לאחר ביצוע Degas לבסיס האלסטומר, מזגו אותו בעדינות לתבנית התא המיקרופלואידי.

השאירו את תערובת האלסטומר להתבשול על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 70 °C למשך שעתיים. לאחר ההבשלה, קלפו בזהירות את דיסק ה-PDMS מהתבנית בעזרת להב תער. דיסק ה-PDMS מכיל ארבע תאים מלבניים בנפח של 30 µL כל אחד.

הדביקו את הצד השטוח של דיסקי ה-PDMS, הצד שאינו מכיל את התעלים, לחלונית זכוכית בגודל אינץ' אחד, על ידי חמצון פלסמה של שני השטחים למשך 30 שניות. חלונית הזכוכית מכילה שמונה חורים בקוטר שני מילימטרים בשני קצות התעלים, אשר נקדחו מראש. לאחר מכן, הכניסו צינור קפילרי גמיש מסיליקה מותכת באורך שני אינץ' דרך כל חור בחלונית הזכוכית.

על מנת לעשות זאת, הכניסו תחילה מחט ולאחר מכן הכניסו את צינור הנימי עד שיגיע לתעלה. אטמו את החורים בחלון הזכוכית באמצעות תרכובת יציקה של סיליקון בעלת זמן ייבוש מהיר, כגון quick cast. שטפו את התעלות באתנול ובמים לאחר הפעלת פלזמה של התא ושל כיסוי קוורץ מעגלי בן שעה אחת שנקי בשיטת piranha למשך 30 שניות.

הדביקו את כיסוי הזכוכית (cover slip) לדופן התא המכיל את התעלות. התאים כעת אטומים. השאירו את התא המורכב להתייבש למשך לילה בטמפרטורת החדר.

לאחר שה-microfluid Excel המורכב עבר פילמור למשך הלילה, הוא מונח במחזיק ייעודי ומותקן על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להתחיל בהפעלת פני השטח של התא. לצורך קיבוע מולקולות, חברו צינור גמיש לקפילריות של התא כדי לאפשר הזרקת בופר באמצעות מזרק ומחט. כעת, הזריקו לתעלה תמיסה של 0.1 mg/mL biotinylated BSA בבופר A והדגירו למשך 30 דקות לפחות.

לאחר דגירה של 30 דקות, הזרם 300 עד 500 µL של בופר A כדי להסיר BSA ביוטינילי encrypted שלא נספג מהתעלה; יש להקפיד שלא יכלואו בועות אוויר בתא. לאחר מכן, הזרם תמיסה של 0.1 mg/mL STR din בבופר A ודגירה למשך 15 דקות.

לאחר דגירה של 15 דקות, העבירו 300 עד 500 µL של בופר A כדי להסיר כל strep din שלא נספג מהתעלה. כפי שנעשה קודם לכן, הימנעו מלכידת בועות אוויר בתא. לבסוף, העבירו תמיסה של 3 עד 5 pM של הדגימה הביוטינילית.

כדי לבדוק את הכיסוי של המולקולות הפלואורסצנטיות, יש לבצע סריקה של השטח. דגרו את הדגימה הביוטינילית למשך 10 דקות וחזרו על זרימת הבופר. כפי שהוצג קודם לכן, בופר הדימיג' (Imaging Buffer או IB) מורכב ממערכת אנזימטית לספיחת חמצן וממכבה טריפלט (triplet quencher) כגון trol locks, כדי להמיס תחילה את ה-IB.

המסו 5 mg של trol ב-10 mL של בופר גלוקוז באמצעות וורטקס למשך מספר דקות ונעורה למשך 10 דקות לפחות. סננו את התמיסה והשאירו אותה לניקוז גזים בוואקום למשך 10 דקות. ערבבו בעדינות את תמיסת ה-TRO lock עם התמיסה האנזימטית של Glocky, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר.

מלאו את המאגר בתמיסת ה-IB. לאחר מכן, השתמשו במשאבת מזריקים מכנית כדי לשלוט בקצב הזרימה; העבירו את ה-IB דרך התעלה בקצב קבוע של 5 µL לדקה, והנפיחו גז ארגון אל מאגר ה-IB כדי למנוע התמוססות של חמצן מהאוויר לתוך התמיסה. סריקת הפני השטח, איתור המולקולות והשגת עקומות עצימות של מולקולה בודדה מבוצעים באמצעות תוכנת LabVIEW, הסורקת שטחים של 20 על 20 µm² ברזולוציה של 0.2 µm ובקצב של 0.1 µm למילישנייה.

הנתונים מסריקת הפני השטח מעובדים באופן מיידי כדי להפיק את מיקומי הפיקסלים המשוקללים לפי עוצמה של כל הפיקסלים שמעל רמות הרקע. ברגע שנמצאים המולקולות המקובעות, הן מועברות אחת אחת אל הנפח הקונפוקאלי, ועוצמותי הדיוור (donor) והמקבל (acceptor) נרשמות כפונקציה של זמן עד להלבנה פוטוכימית (photobleaching) של שני הפלואורופורים. לאחר מכן, הבמה מתוכנתת לנוע אל נקודת מוצא חדשה, במרחק של 100 מילימטרים, ותהליך הסריקה חוזר על עצמו.

מכשיר ה-MICROFLUID Excel המורכב מוצג כאן. אלו הן סריקות פני שטח המראות מולקולות בודדות בערוצי התורם הירוק והמקבל האדום. מוצגים כאן מספר עקבות טיפוסיים של מולקולות בודדות, המראים את עוצמת המקבל באדום ואת התורם בירוק.

הרגע הראינו לכם כיצד להשיג עקבות של מולקולה בודדת ממולקולות ביולוגיות מקובעות באמצעות מערך קונפוקלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב בקפידה ולהקדיש לכך את הזמן הדרוש, שכן זהו ניסוי מאתגר. וזהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.