Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

התהליך השלבבי לכליאה של תאים מתחיל בהכנה וסטריליזציה של תבניות הידרוג'ל וחומרים אחרים, ולאחריהם בידוד התאים לאוכלוסיות נפרדות, לתוך מבחנות עבור כל סט של ג'לים. לאחר מכן מבוצע תהליך הכליאה בנוכחות התאים, ולאחר מכן תקופת דגירה in vitro או in vivo. ניתוחים המשכיים של התנהגות התאים עשויים לכלול בדיקות לבדיקת חיוניות, מורפולוגיה, שגשוג ודיפרנציאציה.

שלום, אני אמידיו קהאן מהמעבדה של ד"ר ג'ייסון ברדיק במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת פנסילבניה. היום נדגים לכם פרוצדורה לכליאה תאית בתוך הידרוג'לים תלת-ממדיים עבור הנדסת רקמות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לבחון את השפעות ההרכב והמבנה של ההידרוג'ל על התנהגות התאים הכלואים.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסה בריכוז 0.5% weight של הפוטו-איניציאטור air cure 2 9 5 9 או I 2 9 5 9 ב-PBS. ערבבו והדגירו למשך יומיים עד שלושה ימים בחושך בטמפרטורה של 37 °C.

כאשר התמיסה מוכנה, השתמשו במסנן מזרק כדי לעקר אותה ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת גיליונות נתונים כגון Microsoft Excel כדי לחשב את כמות הפולימר והמקשר (crosslinker) הנדרשים כפי שהודגמה. כאן מוצגת חומצה היאלורונית שפונקציונלונה עם קבוצות תגובתיות של אקרילט.

חשבו גם את הכמות של הפפטיד התלוי המכיל את הדומיין הדביק הפונקציונלי עם חומצות האמינו cystine, arginine, glycine ו-aspartate. ה-cystine משמש לעיגון לפולימר. כעת, לאחר שנקבעו הכמויות הנדרשות של מקשר הפולימר (polymer crosslinker) והפפטיד, שקלו אותם והניחו כל אחד מהם בשפפורת איפנדורף (eppendorf tube).

עדכנו את גיליון החישוב בהתאם. עבור המסה בפועל של הפולימר שהתקבל, עברו לשלב הכנת תבניות הג'ל. השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את הקצוות של הטיפים הסטריליים העטופים בנפרד.

מזרקים חד-פעמיים של מיליליטר אחד. ודאו כי החיתוך הוא שטוח עבור התבניות שישמשו לדפוסי תמונה עבור הג'לים. לבסוף, סטריליזציה של תבניות המזרקים, צינורות ה-EOR עם הפקקים פתוחים וכל חומר נחוץ אחר על ידי הנחתם תחת מקור אור גרמיצידי המובנה בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות.

בסיום הסטריליזציה, התקדמו להכנת התאים לאחר סטריליזציה של הציוד הניסיוני. עבדו במנדף והוסיפו TEA סטרילי לפולימר המשמש לקשירה צולבת מסוג mical, ו-PBS סטרילי לפולימר המשמש לקשירה צולבת של רדיקלים חופשיים. הוסיפו באפר תואם למבחנות ה-pendant moiety וערבבו באמצעות וורטקס.

כדי להמיס את רכיב התליה (pendant moiety), קשרו אותו לחומצה היאלורונית מאלקילציה באמצעות תיול מקבוצת INE שעל הפפטיד כדי לחבר את רכיב התליה לפולימר; הוסיפו אותו לתמיסת הפולימר ואטמו עם param. בקצרה, ערבבו ב-vortex והדגירו בטמפרטורה של 37 °C תוך ערבוב. בזמן שרכיב התליה נקשר, הכינו את התאים המיועדים לאנקפסולציה, תאי גזע מזנכימליים אנושיים או HMCs, על ידי שטיפתם ב-PBS.

לאחר מכן, דגרו עם trypsin למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, הסירו את ה-trypsin ודגרו חמש דקות נוספות ב-37 degrees. לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול HMSC כדי לנטרל את ה-trypsin ולשחרר את התאים מפני השטח של הפיתה. ספרו את התאים באמצעות hemo cytometer.

חלקו את התאים שנספרו למנות המכילות את המספר המתאים עבור כל סט של ג'לים. עבור סט של שלושה ג'לים של 50 µL בצפיפות של 10 מיליון תאים ל-mL, העבירו 1.5 מיליון תאים לשפופרת קונית נפרדת. אין להכין יותר מארבעה ג'לים בסט בודד בשל תזמון הפעולה.

בשלב הבא, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 RCF למשך שש דקות. בזמן ששקיעת התאים מתבצעת בטמפרטורת החדר, הכינו את תערובת הפולימריזציה עבור קישור הצולב של מהדורת המיקל (mical edition). הוסיפו באפר למקשר הצולב (crosslinker) כדי להגיע לריכוז המתאים.

עבור קשירת הצלבה של רדיקלים חופשיים המופעלת על ידי אור, הוסיפו את תמיסת ה-I 2 9 5 9 שהוכנה קודם לכן לתמיסת הפולימר. הוסיפו 10% מנפח הקשירת הג'ל הכולל, כדי להגיע לריכוז ראשוני סופי של 0.05% משקל. כעת התאים ותערובת הפולימריזציה מוכנים לכליאה בתוך ההידרוג'ל.

התחילו בשאיבת הנוזל מהתאים שנצנטריגו. המתינו שהנוזל ישקע לאחר השאיבה הראשונית ושאבו שוב כדי להסיר כמה שיותר מדיום מבלי להפר את משקע התאים. השביו את משקע התאים עם תמיסת הפולימר כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

שאוב את התמיסה באיטיות למעלה ולמטה כ-10 פעמים, פעולה שצריכה להספיק לפיזור אחיד של התאים. עבור תגובת הוספה מסוג mical, השתמש בקצה פיפט רחב כדי להוסיף את הנפח המתאים של תמיסת המקשר (crosslinker) לתא הפולימר. ערבב. כוון את הפיפט לנפח הג'ל האינדיבידואלי הרצוי.

שאיף והזרק את התמיסה באמצעות פיפטה כדי להומוגנז אותה, והעבר אותה לתבניות קצות המזרקים. בצע את השלב במהירות כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים, והמתן 10 עד 30 דקות של דגירה במנדף התרביות לצורך קשירה צולבת. עבור קשירה צולבת של רדיקלים חופשיים המופעלת על ידי אור.

העבירו את הנפח המתאים לתבניות של קצות מזרקים. חשפו את המזרקים לאור UV לצורך קשירה רדיקלית (radical cross-linking) בחשיפה של 10 דקות ל-365 nanometer. אור UV בעוצמה של Four milliwatts per centimeter squared נפוץ עבור פולימרים פונקציונליים מסוג ACRL.

בצע את השלב במהירות כדי למזער את שקיעת התאים לפני החשיפה לאור UV. לאחר קישור הצלבה, טבול את הג'לים לבארות של פלטת תרבית רקמות המכילה מצע גידול לצורך דגירה ואנליזה. ניתן לבצע את קישור הצלבה של ההידרוג'ל גם באופן סדרתי.

ראשית, הוסף את הצבע הפונקציונלי metholated rumine עד לריכוז סופי של 20 nanomolar בג'ל. הצבע מסייע בוויזואליזציה של התבנית מכיוון שהוא נטמע באופן מועדף באזורים בעלי קשירה צולבת רדיקלית בג'ל. לאחר מכן, התחל בתגובת פולימריזציה מסוג mic המניבה שבר מהקשירות הצולבות התאורטיות עבור השלבים הבאים.

עבור קשירה צולבת באמצעות רדיקלים חופשיים, יהיה צורך להשתמש במסכה שתוכננה בתוכנה כגון Adobe Photoshop או Illustrator והודפסה ישירות על מסכות שקופיות. ממדי המסכה חייבים להתאים לחלק העליון העגול של המזרק. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח מסכה סטרילית ישירות על פני השטח של הג'ל, ולאחר מכן חשפו אותו לאור כדי לבצע קשירה צולבת של הג'ל.

כאן מוצגים HMCs בתוך הידרוג'לים מבוססי HA שעה אחת לאחר הכליאה. מכיוון שהידרוג'לים מסונתזים הם בדרך כלל שקופים, ניתן להדמיא את המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופיה של אור. אותם תאים הודמיו לבדיקת חיוניות 24 שעות לאחר הכליאה באמצעות ערכה לצביעת חי-מת פלואורסצנטית.

השתמשנו ב-calcium M כדי לזהות תאים חיים וב-atherium homodimer עבור תאים מתים, וצפינו בבקיאות של מעל 95%. השתמשנו גם בבדיקת alamar blue כדי לקבוע את רמת השגשוג התאי, שנמדדה על פי היכולת של התאים למטבליזם את ריאגנט הבדיקה, מה שמוביל לשינוי בצבע. צביעת התאים בוצעה על H HMCs שבעה ימים לאחר כליאה בתוך הידרוג'ל מבוסס HA הניתן לפירוק והדבקתי, תוך שימוש בפרוצדורות קיבוע והחדרה סטנדרטיות.

ניתן להבחין באקטין תאי באמצעות פאלואין המסומן בפלואורסצאין ובגרעינים שסומנו ב-dpi. צביעה אימונוהיסטוכימית נגד cullin משמשת לוויזואליזציה של נקודות היצמדות (focal adhesions) בתוך מטריצת ההידרוג'ל. צביעה היסטולוגית מבוצעת לאחר דהידרטציה, טמיעה בפראפין וחיתוך של ההידרוג'לים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור הידרוג'לי HA עם HMSC encapsulated שעברו פולימריזציה רדיקלית.

לאחר שבוע אחד בתרבית, בוצע צביעה ב-hematoxylin לסימון הגרעינים, וב-ASIN לסימון רקמת החיבור, וצביעות כחולות עבור גליקוזאמינוגליקנים. Real-time PCR משמש לכימות הדיפרנציאציה של תאי גזע encapsulated. לאחר חיסור הרקע, רמת הביטוי של הגן הנחקר נקבעת לפי מספר המחזורים שבהם הושגה פלואורסצנציית סף, בהשוואה לאות ייחוס פסיבי, שהוא גן בית (housekeeping gene) פעיל באופן קבוע. כך הצגנו בפניכם כיצד לבצע encapsulation לתאים בתוך הידרוג'לים בתלת-ממד ולחקור את התנהגות התאים בתוך הג'לים.

בעת שימוש בפרוצדורות אלו, חשוב להבטיח סטריליות מלאה של החומרים, בין אם על ידי שמירה של תמיסות בופר וריאגנטים סטריליים לטווח ארוך ובין אם על ידי סטריליזציה באמצעות מנורת UV קוטלת חיידקים. זהו כל השלב. תודה על השטיפה ובהצלחה בניסויים שלכם.