מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

פרוטאומיקה קלינית היא דיסציפלינה חדשה וחשובה המבטיחה גילוי של ביומארקרים שיהיו שימושיים לאבחנה מוקדמת ולפרוגנוזה של מחלות. כאן אנו מדווחים על שיטה חדשה של מיקרופלואידיקה דיגיטלית, או DMF, המשלבת מספר שלבי עיבוד המשמשים בפרוטאומיקה קלינית, כולל מיצוי חלבונים, רה-סולביליזציה, רדוקציה, אלקיליזציה ועיכול אנזימטי. DMF משתמשת בטיפות מיקרו בודדות של חלבוני דגימה על מערך של אלקטרודות ויכולה להופעל בטמפרטורת החדר, מה שמאפשר ניתוח אוטומטי ומקבילי של דגימות.

מתודולוגיה זו מהווה התקדמות משמעותית לעומת שיטות קונבנציונליות ובעלת פוטנציאל להוות כלי חדש ומועיל בפרוטאומיקה קלינית. שלום, אני סטיב שגי (Steve Sche) מהמעבדה של פרופסור ארין וילר (Erin Wheeler) במחלקה לכימיה ובמכון לביומטריאליים והנדסה ביומדית באוניברסיטת טורונטו. שלום, אני גבריאל (Gabriel) ממעבדת וילר באוניברסיטת טורונטו.

ואני ויויאן לוק, גם אני ממעבדת וילר באוניברסיטה של טורונטו. אני ארין וילר. אני בת מזל לעבוד עם סטיב מייס ויויאן.

היום נדגים לכם פרוצדורה לעיבוד פרוטאומי באמצעות מיקרופלואידיקה דיגיטלית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור חלבונים ודגימות ביולוגיות. אז בואו נתחיל.

התחילו את הפרוצדורה במכסה העשונים על ידי ניקוי מצעי הזכוכית בתמיסת Piranha. בעודכם לבושים במיגון הולם, שימו לב שתמיסת Piranha מורכבת מחומצה גופרתית מרוכזת ומי חמצן 30% ביחס של שלושה לאחד, ולכן יש לנקוט משנה זהירות בעבודה עימה.

הדגרו את מצעי הזכוכית בתמיסת piranha למשך 10 דקות, ולאחר הניקוי, שטפו אותם במים דאיוניים או מזוקקים ויבשו את המצעים באמצעות גז חנקן. הניחו את המצעים בתוך תא אידוי באלומה אלקטרונית להשקעת כרום בעובי של 250 nanometers. הוציאו את המצעים מהתא ברגע שהושג עובי זה ושטפו אותם באיזופרופנול, ולאחר מכן יבשו על פלטה חמה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 115 °C.

הכינו את התשתיות המיובשות באמצעות hexa methyl xylazine או HMDS על ידי ציפוי סבב (spin coating) למשך 30 שניות. בצעו ציפוי סבב פעם נוספת ב-3000 RPM עם Shipley S 1811 photoresist תוך שימוש בפרמטרים זהים.

בצעו אפייה מוקדמת של התשתית ישירות על פלטה חמה בטמפרטורה של 100 °C למשך מספר דקות. לאחר מכן, צרו תבנית של הפוטורזיסט על ידי חשיפה לקרינת ultraviolet או UV למשך חמש שניות דרך מסיכה פוטוגרפית. לאחר מכן, פתחו את התשביות שנחשפו ל-UV במפתח Shipley MF 3 21 בכמות מספיקה כדי להטביע את התשתית למשך שלוש דקות.

שטפו את התשתית במים מזוקקים (DI water). החליתו ישירות על פלטה חמה בטמפרטורה של 100 °C למשך דקה אחת. תגרו את הכרום החשוף על ידי טבילת התשתיות למשך 30 שניות בכמות מספיקה של חומר תגריר כרום כדי לכסות אותן לחלוטין.

שטפו את התשתיות במים מזוקקים (DI water) והטבילו אותן במסיר צילום (stripper) מסוג Z 300 T בכמות המספיקה לכיסוי מלא של התשתית למשך 10 דקות, כדי להסיר את שאריות הפוטורזיסט. שטפו במים מזוקקים (DI water) ויבשו בגז חנקן.

בעקבות השכבה זו, יש להשקיע פולימר מבודד מסוג Paraline C בעובי של שני עד חמישה מיקרומטר על התשתית באמצעות שיקוע אדי כימיים. לאחר מכן, יש להשקיע 50 ננומטרים של Teflon AF כדי להפוך את הפני השטח להידרופוביים, על ידי ציפוי סבב (spin coating) של תמיסה בריכוז 1% w/w של fluorinert FC 40 במהירות של 2000 RPM למשך 60 שניות על התשתית.

חזור על הפעולה עם מצע זכוכית של indium tin oxide או ITO שאינו פסיבי כדי ליצור את מוט הפלטה העליונה. אפו את שני המצעים על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 160 °C למשך 10 דקות כדי להכין את מכשיר המיקרופלואידיקה הדיגיטלי.

הסר את ציפויי הפולימר ממישקי המגע של מצע תחתון באמצעות גירוד בסכין מנתחים. חבר את המגעים החשופים של המצע התחתון למחברים של 40 פינים והפעל מחשב המריץ LabVIEW. אנו משתמשים בתיבת בקרה שנבנתה במעבדה המכילה ממסרים שסיגנליהם נשלטים באמצעות dpad.

תיבת הבקרה הממוחשבת מאפשרת למשתמש לשלוט בהפעלת אותות של 100 volts RMS בתדר של 18 kilohertz על ההתקן באמצעות מחברי ה-40 פינים. כמו כן, הפעל גנרטור פונקציות ומגבר. הרכב את ההתקן על ידי הצמדת שתי פיסות של סרט דביק דו-צדדי בעובי כולל של 140 micrometer לקצוות של המצע התחתון.

העבירו בפיפט ארבעה µL של DI water לאחד מהמאגרים וסגרו את המכשיר על ידי הנחת שקופית indium tin oxide ללא תבנית מעל המכשיר, כאשר הצד המצופה בטפלון פונה כלפי מטה. חברו מחבר הארקה לפלטה העליונה. הריצו את תוכנית האתחול שנוצרה במעבדה ב-LabVIEW כדי לכייל את בקרת המשוב; המכשיר מוכן כעת לניסויים.

בפרוטוקול זה, נשתמש באלבומין ממעי בקר או BSA כדגימת חלבון כדי להדגים את התכנון והשימוש במערכת המיקרופלואידיקה הדיגיטלית שלנו. BSA מדולל בבופר עבודה או WB המורכב מ-100 millimolar tris HCL pH 7.8 עם 0.08%onic F1 27 weight per volume. הכין מיליליטר אחד מכל דגימה ומכל תמיסת ריאגנט, וסמן את המאגר אליו הם יתווספו.

לאחר הכנת הריאגנטים, הסר את הפלטה העליונה מהמכשיר והעבר בעזרת פיפט 4 µL מהתמיסה למאגר המיועד לה. לאחר מילוי המאגרים, החזר את הפלטה העליונה למקומה על המכשיר. השתמש בתוכנת ה-LabVIEW הפנימית של המעבדה כדי לבצע את השלבים הבאים.

זכרו, ממשק המחשב מאפשר למשתמש להניח טיפות של כ-600 nanoliter מהמאגרים ולתמרן את הטיפות על מערך האלקטרודות. ראשית, הניחו טיפה של דגימה המכילה חלבון מ-R one וטיפה של משקיף מ-R two.מזגו את שתי הטיפות יחד ואפשרו לטיפה המאוחדת להדגיר למשך חמש דקות כדי שהחלבונים ישקיפו על פני השטח.

העבירו את הנוזל העליון מהחלבון המשקע אל מאגר הפסולת. בשלב R three, כדי לשטוף את החלבון המשקע, העבירו שלוש טיפות של תמיסת שטיפה מ-R four, והנחילו אותן על פני החלבון המשקע אל מאגר הפסולת. המתינו עד שהמשקע יתייבש והניחו טיפה של תמיסת המסה מ-R five על החלבון.

יש להמתין 20 דקות להדגרת הבופר עד להמסת המשקע. לאחר מכן, יש להעביר טיפה של חומר מחזר מ-R six ולאחד אותה עם טיפת הדגימה. ערבבו את הטיפה המאוחדת על ידי העברתה מעל שש אלקטרודות בתבנית מעגלית.

השאירו את הטיפה להדגרה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. העבירו טיפה של חומר אלקיליציה מ-R seven ומזגו אותה לתוך טיפת הדגימה, ולאחר מכן ערבבו. השאירו את הטיפה להדגרה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תחת הגנה מאור.

לבסוף, העבירו טיפה של trypsin מ-R eight ומזגו אותה לתוך טיפת הדגימה, ולאחר מכן ערבבו. הניחו לטיפה להתרגב במשך שלוש שעות ב-37 °C בתוך צלחת פטרי על פלטה מחממת. כדי לסיים את התגובה, הסירו את הפלטה העליונה ועצרו את העיכול באמצעות פיפטור.

טפטפו 0.6 מיליליטר של 2.5% חומצה טריכלורואצטית במים על טיפת התגובה. טהרו את תוצר התגובה שעוצר בסיפון של טיפת הדגימה ישירות מהפלטה התחתונה. באמצעות C 18 zip tip, בהתאם להוראות היצרן, ניתן כעת לדלל את הדגימות לפי הצורך ולהעריכן באמצעות ספקטרומטריית מסות כדי לזהות את החלבונים בדגימה באמצעות מערכת זו.

לאחר מכן, חלבונים זוהו באמצעות ספקטרומטריה של מסות עם ציוני הסתברות של פחות מ-1 × 10⁻³, שווה ערך לרווח סמך של 99.9% וכיסוי רצף של לפחות 30%. לפיכך, DMF היא מתודולוגיה שימושית מאוד לעיבוד אוטומטי של דגימות פרוטאומיות. כך הצגנו היום כיצד אנו מנצלים מיקרופלואידיקה דיגיטלית כדי למצות ולעבד חלבונים באופן אוטומטי. מתודולוגיה זו מספקת פתרון פוטנציאלי לאובדן דגימות ולזיהום במהלך בידוד וזיהוי חלבונים.

אנו מקווים להחיל שיטה זו בעתיד על יישומים ביולוגיים אחרים, כולל בדיקות אימונו-סריקה (immunoassays) ובדיקות מבוססות תאים. בעת ביצוע סוג זה של ניסוי, הדבר החשוב ביותר הוא לזכור ליהנות ממנו. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.