הנדסה Cell-חדיר חלבון

במהלך 15 השנים האחרונות ניתן היה להשיג מניפולציה של תפקוד תאי באמצעות הגישות הקלאסיות של טרנספקציית DNA או טרנסדוקציה ויראלית. שיטה נוספת התפתחה: בטרנסדוקציית חלבונים, ניתן להחדיר חלבון פעיל ביולוגית ישירות לתאי יונקים באמצעות פפטידים קטנים המחוברים לחלבון המדובר, דבר המקדם את הספיגה התאית.

מכיוון שאין שימוש ב-DNA, נמנע הסיכון להיווצרות אגנזיס. בניגוד לשיטות הקלאסיות שהוזכרו לעיל, טרנסדוקציית חלבונים מאפשרת הובלה של חלבונים באופן שניתן לתיתור (titratable).

יתרה מכך, ניתן לבצע מודולציה לאוכלוסיות תאים קטנות וכן לתאים שאינם מתחלקים, כגון נוירונים פוסט-מיטוטיים. כדי לבטא חלבון רקומביננטי בצורה יעילה, אנו ממליצים להשתמש במערכת הווקטורים Paciz. זוהי מערכת וקטורים מודולרית המורכבת מווריאנט של קצה N ווריאנט של קצה C.

שני הווקטורים מאפשרים הכנסה קלה של הגן המבוקש לצורך טהרה. תג היסטידין שולב יחד עם דומיין טרנסדוקציה של חלבון. במקרה שלנו, זהו רכיב מנגיח מנגיף HI המקדם ספיגה תאית לצורך הפצה תאית.

אות למיקום גרעיני משלים את הווקטור; מסיבות של בקרה, ניתן להסיר את תגי ההיתוך בפשטות. בנוסף, לסידור של תגים אלו עשוי להיות השפעה משמעותית על תכונותיהם של חלבוני ההיתוך. ההשפעה על היבול והטוהר, כמו גם על היכולת למכור ותפקוד ביולוגי, אינה ניתנת לחיזוי.

שלום, שמי ברנארד מוס ואני עובד בקבוצת הנדסת תאי הגזע במכון לנוירוביולוגיה רקונוסטרוקטיבית בבונד, גרמניה. שלום, שמי כריסטוף פ' וגם אני חבר במעבדת הובר. קבוצת העבודה שלנו עושה שימוש אינטנסיבי בטכניקת טרנסדוקציית חלבונים להחדרה ישירה של חלבון פעיל ביולוגית לתאים פטורים שונים, והיום אנו רוצים להדריך אתכם בתהליך הביטוי והטיהור בתוך ומתוך e coli.

לאחר מכן, נרצה להראות לכם כיצד ליישם חלבון היתוך קבוע בתרבית תאים כדי להדגים את התהליך השלם של ביטוי, ניקוי ויישום. אנו משתמשים ברקומינציה ספציפית לאתר באמצעות Cre כדי לבצע שינוי גנטי בתאי גזע של עכבר. אוקיי. אוקיי. בואו נתחיל.

כדי להחדיר את התרבית לגידול למשך לילה, אנו משתמשים בחיידקים שעברו טרנספורמציה וכבר מאוחסנים במאגר גליצרין בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. חיידקים אלו מכילים כבר את הווקטור המקודד לרקומינציה של decre. בעזרת טיפ של פיפט, גורדים כמות קטנה של חיידקים אל תוך הטיפ ומעבירים אותם אל תוך הכלי המכיל את התרבית לגידול למשך לילה.

התרבית של הלילה מורכבת ממצע LB שנוסף לו גלוקוז בריכוז סופי של 0.5% ו-50 מיקרוגרם של carbonic insulin ל-ml. לאחר מכן, הכלי מוכנס למדגרה הפועלת בטמפרטורה של 37 °C לצורך ביטוי של ה-Recombinate Cree הספציפי לאתר. עבור תרבית הביטוי בקנה מידה גדול, אנו משתמשים במצע TB שחומם מראש.

כדי להאיץ את הביטוי, אנו ממליצים להשתמש במצע TB המחומם ל-37 °C, המייצג את הטמפרטורה בזמן הביטוי של החלבון הרקומביננטי. לאחר מכן, אנו מוסיפים גלוקוז למצע ה-TB בריכוז סופי של 0.5%. הגלוקוז מונע ביטוי בסיסי מוגבר של חלבון היתוך במהלך צמיחת תרבית הביטוי לפני ההשראה. לבסוף, מוסיפים אמפיסילין לתרבית הביטוי בריכוז סופי של 100 µg/ml כדי להבטיח תרבית טהורה המכילה רק את החיידקים שעדיין נושאים את הפלסמיד המקודד עבור חלבון ה-decree.

כעת ניתן לקחת את התרבית מהגידול הלילי ולהחדיר אותה לתרבית הביטוי ביחס של 1 ל-50. לאחר מכן, מעבירים את הכוסים למדגרה המופעלת בטמפרטורה של 37 °C. יש לדגום את התרבית כדי למדוד את הצפיפות האופטית באופן קבוע לאורך תהליך הביטוי.

ברגע שהתרבית הגיעה לצפיפות אופטית של 1.5, משרים את החיידקים בריכוז סופי של 0.5 millimolar של IPTG. לאחר שעה אחת של השראה, מעבירים את תרבית הביטוי למבחנות ולאחר מכן קוצרים אותה באמצעות סנטריפוגציה. לצורך כך, אנו משתמשים ברוטור SLA 3000.

הצנטריפוגה פועלת במהירות של 5,000 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן נשפך העל-נוסח (supernatant) ואת משקע הבקטריות ניתן לאחסן ללא הגבלה בטמפרטורה של 20°C- . את המשקעים הקפואים מרחיפים מחדש בבופר Lysis, בכמות התואמת לליטר אחד של תרבית ביטוי.

אנו משתמשים ב-10 mls של בופר lizza וממתינים כ-15 דקות עד שהתמיסה תהיה הומוגנית. לאחר מכן, מוסיפים מיליגרם אחד של lysozyme לכל ML של תרחף. התמיסה מומסת למשך 20 דקות כדי לאפשר לאנזים לפרק את החיידקים.

בשלב הבא, מוסיפים Benzonase בדילול של 1 ל-1000 למשך 15 דקות נוספות, דבר שיגרום לחיתוך של ה-DNA ולהיווצרות תמיסה שאינה צמיגית. לבסוף, משתמשים בסוניקטור כדי להבטיח ליזיס של התאים. התוכנית פועלת במשך דקה וחצי בהספק של 45% לאחר השלמת התהליך.

זכרו לדגום כל שלב כאן, את הליזט הגולמי או את ניתוח ה-SDS page של הטיהור. כעת חשוב מאוד להוסיף 1 ml של תמיפת TSB קרה מהקרח לכל ML של תרחיף, שכן חלבון שאינו מטוהר נוטה לשקוע בתוך מלאי הגליקרול. אם בכוונתכם לדלג על שלב זה, ערבבו את התמיסה לזמן קצר והליזט הגולמי מוכן כעת לסנטריפוגציה.

לצורך כך, אנו משתמשים ברוטור SS 34. הצנטריפוגה פועלת במהירות של 17,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. עם סיום התהליך, הועבר בזהירות supernatant מהצנטריפוגה למבחנות פלקון (Falcon tubes) נקיות בנפח 50 ml.

כעת הוסיפו את תמיחת הניקל-anti A לנוזל העליון. Anti A הוא ריאגנט חיוני לניקוי נכון של חלבוני היתוך עם תג היסטידין. ההיסטידין יוצר קומפלקס עם יוני הניקל המאפשר ניקוי באמצעות זיקה (affinity purification). כעת נערנער בעדינות את מבחנות הפארקינג למשך 60 דקות בטמפרטורה של 40 °C.

לאחר שעה, ניתן כעת להעביר את התרחיף לעמודות של 20 ML ולאפשר לתמיסה לזרום דרכן בכוח הכבידה. עבור ייצור בקנה מידה גדול, ניתן לפצל את התרחיף למספר עמודות. לאחר מכן, נשטוף את העמודה פעמיים עם באפר המכיל 15 millimolar של innersole.

כמות הבאפר המיושמת תלויה בנפח השרף. שני מיליליטרים של nickel NTA תואמים למיליליטר אחד של שרף לצורך שטיפה. אנו מוסיפים לעמודה נפח של חמישה נפחי שרף של באפר שטיפה לאחר השטיפה, וכעת אנו מוכנים לבצע אלוציה לחלבון שלנו.

לפיכך, אנו משתמשים בבופר אלוציה בריכוז של 250 millimolar של immuno. שימו לב כיצד צבע הסף (resin) משתנה לכיוון ירוק. בשל הריכוזים הגבוהים של חלבון ה-CRE, פראקציית ה-OID הופכת לעיתים לעכורה.

כדי למנוע זאת, ערבבו את התמיסה והוסיפו lys buffer נוסף; כעת כל הפראקציות מאוחדות ומועברות לאחר מכן לתוך tubing לליזיס. הליזיס יסיר את השומנים; שלב הדיאליזה הראשון מבוצע אל מול בופר המכיל ריכוז גבוה של מלח. לאחר שעה, מחליפים את בופר המלח הריכוזי ותהליך הדיאליזה מיושם למשך הלילה.

ביום למחרת, מוציאים את נשוא הדיאליזה מהבופר בעל המליחות הגבוהה ומעבירים אותו לבופר גליצרין. לאחר שלוש עד חמש שעות, מחליפים את בופר הגליצרין ומבצעים שוב דיאליזה במהלך הלילה. ליזיס כנגד בופר גליצרין יביא לתמיסת מלאי מרוכזת פי שלושה לפחות.

ניתן כעת לאחסן את תמיסת המקור בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך מספר שנים ללא אובדן פעילות. לצורכי בקרת איכות, ניתן להעמיס את דגימות ה-SDS page שאספתם על ג'ל ולצבוע אותו לאחר מכן. עבור Kamasi, חלבון היתוך ה-Cree ניתן לזיהוי כפס בולט בפרקציית ה-OID. כדי להשתמש בריכוז המתאים של recombination crew, עליכם לקבוע את הריכוז באמצעות בדיקת Redford.

כיצד להחדיר חלבונים קבועים לתאי יונקים. ראשית, הכינו את תאי המטרה כדי להשיג את יעילות ההחדרה הגבוהה ביותר של החלבון. במקרה שתאי המטרה שלכם הם תאי YES, הגדלים במושבות דחוסות, השגיו תאים בשכבה אחת בצפיפות שתביא לשכבת תאים בעלת 80 עד 90% התמזגות (confluence) למחרת.

הפרידו את התאים והפכו אותם לסספנסיות תאים בודדים חמש שעות מראש. חשוב להכין סספנסיות תאים בודדים לפני טרנסדוקציה של חלבונים, מכיוון שאלמלא כן, רק תאים הנמצאים על פני השטח של מושבה יוכלו לעבור טרנסדוקציה. שאבו את המדיום ובחנו בקצרה את התאים באמצעות PBS לפני הטיפול בתריpsin.

הסר את שאריות המצע העשיר המכיל סרום. לאחר שאיבת שכבת ה-PPS, שטוף את התאים והשאר אותם לדגירה למשך שלוש עד חמש דקות. כעת, בדוק תחת המיקרוסקופ אם כל המושבות התפרקו לתאים בודדים.

מהסיבות שהוזכרו לעיל, זהו שלב קריטי עבור טרנסדוקציה של חלבונים לתאי שמרים. העבירו תאים נפרדים לשפופרת. הניחו את השפופרת במכשיר צנטריפוגה, סובבו את התאים למטה, שאבו את הנוזל העליון ושחזרו את התאים בתמיסה.

במדיום גידול, דללו את התאים למספר התאים המתאים. הדבר תלוי, כמובן, בגודל של תרבית הרקמה. דגרו את התאים בצלחת למשך חמש שעות נוספות.

פעולה זו תעניק לתאי האוויר זמן מספיק להיצמד לתחתית ולגדול כבצמיחה נצמדת. ניתן לאחסן מלאי של שלוש שורות מחלקות במינוס 20 מעלות למשך יותר משנתיים. בעבודה עם חלבון היתוך קבוע של תאים רקומביננטיים, ישנו יתרון רב בקיומו של תמיס מלאי כזה שניתן להשתמש בו לפי דרישה.

בזמן ההמתנה להיצמדות התאים לכלי, ניתן להכין את מדיום ההדבקה של ה-C על ידי דילול פשוט של נפח מתאים של חלבון cell permanent creep מתוך מלאי כולסטרול לתוך מדיום עצמי. מכיוון שהתמיסה מהמלאי של Clare אינה סטרילית עדיין, יש לסנן את מדיום ההדבקה בסינון סטרילי לפני השימוש. אנו ממליצים להשתמש במזרק שניתן להבריג למסנן קושר חלבון של lobe.

ריכוז ה-creek הסופי תלוי בסוג התא או בתוספי המדיום. לדוגמה, לסרום יש השפעה שלילית חזקה על יעילות ההעברה (transduction). ניתן להתגבר על כך באמצעות שימוש במדיום נטול סרום או על ידי הגדלת ריכוז ה-creek.

מצאנו את התנאי האופטימלי המאפשר את יעילות הרקומבינציה הגבוהה ביותר. השתמשו בריכוזי הידרט החל מ-0.5 ועד 10 µM. אנו ממליצים לבחון זמני אינקובציה שונים שבין שש ל-18 שעות.

לאחר חמש שעות של דגירה, הוציאו את תאי המטרה ושאבו את המצע המקשר (cross media). לאחר מכן, החליפו אותו במצע להעברת חלבונים (protein transduction media), והחזירו את התאים למדגרה לדגירה למשך הלילה. שטפו בקצרה את תאי ה-D באמצעות PPS והחליפו את מצע העברת החלבונים במצע ES רגיל.

48 שעות לאחר דגירת התאים, ניתן לזהות ביטוי קבוע של הגן Cre באמצעות צביעת X-gal. תאים עם פנוטיפ בטא חיובי הונדסו גנטית בהצלחה על ידי רקומבינציה ספציפית לאתר. Cre הדיווח.

התאים נושאים את מערכת ה-CRE המשתמשת במבנה Lae לאחר רקומבינציה מתווכת. רצף עצירה המוקף ב-lock P מוסר, וגן דשיין (reporter gene) מסוג luxe מופעל תחת מקדם (promoter) של team. כדי להעריך את יעילות הרקומבינציה בתאי דשיין שעברו טיפול מקדם, יש לקבע את התאים.

שאבו את מדיום הגידול, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS, כסו את התאים ב-4% PFA והדגירו את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים שוב שלוש פעמים ב-PBS. לאחר שאיבת ה-PBS משלב השטיפה האחרון, הוסיפו את תמיסת הצביעה Xal לבארות והדגירו את התאים למשך לילה ב-37 degrees באינקובטור.

ביום למחרת, ניתן לנטר את פעילות Beal באמצעות תאים בעלי צווארון כחול. ניתן לקבוע את יעילות הרקומינציה על פי מספר המושבות הכחולות. בתנאים אופטימליים, ניתן להשיג יעילות רקומינציה הגבוהה מ-90%. ובכן, היום הראינו לכם כיצד לבטא ולטהר רקומינציה ספציפית לאתר מ-e coli.

במחקר הוכחת-ההיתכנות זה, הצלחנו להשרות רקומבינציה ברוב המלחים. אוקיי, זהו זה. בהצלחה בניסויים שלכם.