מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

ניתן להדגים בקלות את הליך התאוששות הפלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימית (FRAP) באמצעות דגימה של מולקולות צבע פלואורסצנטי המפעפפות באופן חופשי. ראשית, קרן לייזר בעוצמה נמוכה נשלחת אל הדגימה כדי ליצור רמת פלואורסצנציה של ייחוס ממולקולות ה-D בתוך נפח המיקוד של הלייזר.

בשלב הבא, פולס קצר של לייזר בעוצמה גבוהה נשלח כדי לבצע פוטו-הלבנה (photobleaching) של חלק ממולקולות הצבע בתוך נפח המוקד. לבסוף, עוצמת קרן הלייזר מוחלשת חזרה לרמה הנמוכה הקודמת, והפלואורסצנציה מנוטרת בעוד המולקולות שעברו פוטו-הלבנה מפעפפות החוצה ומוחלפות במולקולות פלואורסצנטיות המגיעות מחוץ לנפח המוקד. עקומת הפלואורסצנציה המתקבלת כפונקציה של זמן מנותחת כדי להפיק את מקדם הדיפוזיה.

שלום, אני קלי סאליבן מהמעבדה של אדוארד בראון במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. היום נדגים לכם כיצד לבצע התאוששות פלואורסצנציה רב-פוטונית לאחר הלבנה פוטוכימית (multi photon fluorescence recovery after photobleaching). אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור דיפוזיה במערכות ביולוגיות הן in vitro והן in vivo.

אז בואו נתחיל. ראשית, הגדירו את אורך הגל הרצוי של הלייזר והכניסו את המסנן המתאים לפני שפופרת הכפל הפוטואלקטרי או ה-PMT. לאחר מכן, כדי למנוע נזק לתא ה-pcal, כוון את הספק הלייזר ל-200 milliwatts או פחות.

שתי מראות מכוונות בצורת הספרה ארבע במעלה הזרם של תא ה-pcal. מראות אלו נחוצות ומספיקות כדי ליישר את קרן הלייזר דרך תא ה-pcal. הגדירו את היסט המתח (voltage offset) בבקר ההטיה של תא ה-pcal לאפס, וכווננו את נתיב הלייזר דרך תא ה-pcal כך שהלייזר יהיה ממורכז בחלונות הקדמיים והאחוריים.

השתמש במראה שמעלה בסידור ה-figure four כדי למרכז את הקרן בחלון הקדמי, ובמראה שמתחת בסידור ה-figure four כדי לממרכז את הקרן בחלון האחורי. כעת הגדר את המתח על גבי גביש תא ה-pcal לערך המקסימלי. הערך המתאים תלוי באורכי הגל וניתן למצוא אותו במדריך ההוראות של תא ה-pcal.

כווננו את המראות באיור 4, שמימון לתא ה-pcal, עד שההספק שיוצא מתא ה-pcal יהיה מקסימלי. כעת השביתו את המתח על הגביש (מתח אפס) וכווננו את היסט המתח (voltage offset) בבקר ההטיה כדי למזער את ההספק שיוצא מתא ה-pcal. החזירו את הספק הלייזר הפוגע בתא ה-pcal לערך הנדרש עבור הניסוי.

כעת נעבור למיקרוסקופ ונבצע מיקוד ויזואלי תקין של דגימה פלורסצנטית סטנדרטית. במקרה זה אנו משתמשים בגרגירי פולן פלורסצנטיים מקובעים. לאחר המיקוד, אטמו את המיקרוסקופ וכווננו את עוצמת הלייזר לרמה המתאימה לדימוי הדגימה באמצעות שינוי המתח על גבי גביש תא ה-pcal.

לבסוף, כבו את האורות והפעילו את ה-PMT. התחילו בסריקת תמונה חוזרת של הדגימה הסטנדרטית וכוונו את המראות במורד הזרם של תא ה-pcal עד לקבלת תמונה חדה של הדגימה. כעת נבחן כיצד לקבוע הספקי ניטור בטוחים במיקוד בתוך הדגימה.

לצורך סרטון זה, נשתמש בדגימה של צבע מימי המוחזקת בתוך שקע בלוחית זכוכית ומכוסה בזכוכית כיסוי. הנמיכו את עוצמת הלייזר לרמה נמוכה אך סבירה ליצירת פלואורסצנציה בתוך הדגימה. אטמו את המיקרוסקופ והפנו את הפלט מה-PMT למונה הפוטונים.

כבו את האורות, הפעילו את ה-PMT והתחילו בסריקת נקודות (point Scan) בתוכנת המיקרוסקופ. הגדירו את מונה הפוטונים לבצע אינטגרציה על פני פרק זמן ארוך בהרבה מזמן ההתאוששות הפלואורסצנציה הצפוי, והקליטו מספר סביר של נקודות נתונים. הגבירו את העוצמה והקליטו סדרה נוספת של נתוני ספירת פוטונים.

המשיכו להעלות את ההספק עד שנראה כי העלייה במניין הפוטונים פוחתת באופן משמעותי. ביחס לגרף עליית ההספק, לוגריתם מניין הפוטונים כפונקציה של לוגריתם ההספק. כל סטייה משיפוע של 2 מעידה על הבהרה (bleaching).

במהלך הניטור, בחרו הספק ניטור סביר הנמוך מערך סף זה. כעת נקבע את פרמטרי הקלט עבור הסופר הרב-ערוצי (multichannel scaler) ומחולל הפולסים. במחולל הפולסים.

הגדירו את זמן ההוראה המוקדמת (pre-teach time) להיות גדול פי אחד עד שניים מזמן מחצית ההתאוששות הצפוי, ואת זמן ההלבנה (bleach time) להיות עשירית מזמן מחצית ההתאוששות הצפוי בסקאלר (scaler). הגדירו את רוחב הסל (bin width) לכמחצית ממשך ההלבנה, והגדירו את מספר הסלים לרישום (bins per record), כך שהמכפלה של רוחב הסל שנבחר ומספר הסלים לרישום תהיה גדולה מזמן ההתאוששות המלא הצפוי. הוסיפו את זמני ה-preble וההלבנה, חזרו למחולל הפולסים והגדירו את התדירות של רצף ה-preble וההלבנה להיות שווה לערך שקטן במעט מההופכי של המכפלה של רוחב הסל כפול מספר הסלים לרישום.

לבסוף, הגדירו את מספר הרשומות לסריקה במספר (scaler) בהתבסס על עוצמת האות בהספק הניטור שבחרתם. כעת, הגדירו את הספק הניטור לרמה בטוחה והגדירו את הספק ההלבנה לסביבות 200 milliwatts מעל סף ההלבנה שנקבע במהלך בדיקת הלבנת הניטור. הספקים הללו מוגדרים שניהם כמתחים שונים על פני אטם הגביש של תא ה-al, וכיבו את האורות במיקרוסקופ.

הפעילו את ה-PMT. התחילו סריקת נקודות (point scan) בתוכנת הדימות. לאחר מכן, הפעילו את מחולל הפולסים ואת הסקאלר.

כדי לנתח את עקומת ההתאוששות שהתקבלה, סמנו שלוש נקודות חשובות: הפלואורסצנציה לפני ההלבנה, הפלואורסצנציה מיד לאחר ההלבנה והפלואורסצנציה בסוף מערך הנתונים. השתמשו בערכי הפלואורסצנציה שלפני ההלבנה ומיד אחריה כדי להעריך טוב יותר את זמן מחצית ההתאוששות.

כעת, השתמשו בכללים שפורטו בשלבים קודמים כדי לעדכן את הערכים עבור ה-preble bleach ומשכי ה-begin width. קחו עקומה חדשה והמשיכו לדייק את הפרמטרים עד שהעקומה המתקבלת תראה bleach חזק והתאוששות חלקה. בדקו אם קיימת רוויית עירור על ידי שרטוט הלוגריתם של פרמטר עומק ה-bleach כפונקציה של הלוגריתם של ההספק.

כל סטייה משיפוע של שני מעידה על רוויית עירור. בחרו עוצמת הלבנה שתניב הלבנה חזקה אך לא תגרום לרוויה. לבסוף, לאחר קביעת הפרמטרים המתאימים, המשיכו בביצוע עקומות התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטונית רב-פוטונית (MP FP) של הדגימה הרלוונטית.

כעת נציג תוצאות מייצגות הן של נתוני ה-FRAP הגולמיים של ה-MP והן של עקומת MP F מנורמלת שעברה התאמה כדי לקבוע את מקדם הדיפוזיה. נתוני ה-MP F FRAP הגולמיים מראים הבהרה חזקה והתאוששות חלקה. ההתאוששות המלאה מדווחת עבור המחצית השנייה של הנתונים כדי להתאימם. ראשית אנו מנורמלים את ההתאוששות לממוצע הפלואורסצנציה לפני ההבהרה, ולאחר מכן מבצעים התאמה לא-לינארית בשיטת הריבועים הפחותים.

ביחס למודל המתאים. שני מערכי הנתונים נלקחו בפלואורסקין מימי ומניבים מקדמי דיפוזיה. בהתאם לספרות המקצועית, הרגע הראינו לכם כיצד לבצע ניסוי של התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטונית (FRAP) באמצעות רב-פוטונים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על הגדרת הפרמטרים הניסיוניים, ובמיוחד את משך ההסרת הצבע (bleach duration) ואת עוצמות ההסרה והניטור, לגבולות הבטוחים המוגדרים בפרוטוקול. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.