ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד
6 בינואר 2010
ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.
התקן ההכנסה להיפוקסיה כולל שישה עמודים המתאימים לבארות של פלטת 6 בארות. גז זורם דרך הרשת המיקרופלואידית בבסיס העמוד ויכול לד diffuse דרך ממברנת PDMS חדירה לגז, המפרידה בין רשת הגז למצע התרבית. התקן זה ממזער את אורך נתיב הדיפוזיה בין מקור החמצן, הרשת המיקרופלואידית בבסיס העמוד והתאים, מה שמאפשר שיווי משקל מהיר יותר של ריכוז החמצן.
המכשיר מאפשר גם שליטה רבה הרבה יותר בתבנית המרחבית של החמצן החשוף לתאים, אשר נקבעת על ידי תכנון רשת הגז המיקרופלואידית המיוצרת באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית עם מסכות פוטו. שלום, אני שון ארד ממעבדתו של ד"ר דייוויד אדינגטון במחלקה לביו-הנדסה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. שלום, אני אלי, גם אני ממעבדתו של אדינגטון.
היום נראה לכם כיצד לייצר, לתקף ולהשתמש במכשיר מותאם אישית לחשיפת תרביות תאים in vitro בלוח של שישה בארות לריכוזי חמצן שונים. השתמשנו בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור את השפעת החמצן על ריפוי פצעים, יצירת מיני חמצן רהאקטיביים ונדידה. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בייצור של התוסף מחמצן, הכינו Polymethyl Sloane או PDMS ביחס של 10 ל-1 בין הפולימר המקדים (pre polymer) לחומר המקשה (curing agent). בהתאם להוראות היצרן, תערובת ה-PDMS מוספת לתבנית Dell ran שעובדה מראש ותוכננה כך שתחקה את הצורה של פלטת תרבית סטנדרטית של שישה בארות. לאחר הקשיה בטמפרטורה של 75 °C למשך לילה, מערך העמודים המודפס שיתקבל יהווה את הרכיב הראשון מתוך שלושה רכיבים המרכיבים את התוסף מחמצן, לצורך ייצור הרכיב המרכזי השני של התוסף מחמצן.
תבנית מאסטר של SU-8 מוכנה תחילה על ידי ספינ-קוטינג (spinning) של SU-8 2150. על גבי פרוסת סיליקון מונחת מסכת פוטומסקה, וה-SU-8 נחשף ל-UV דרך המסכה כדי ליצור תבנית מאסטר עם עובי מיקרו-ערוץ של 300 µm. שופכים PDMS מעל תבנית המאסטר של ה-SU-8 ומקשחים למשך שעתיים בטמפרטורה של 75 °C כדי לקבל תבנית חיובית שתיצור בסופו של דבר את המיקרו-ערוצים בתחתית כל עמוד.
את הרכיב השלישי של ההתקן מייצרים על ידי סבב (spinning) של PDMS על פרוסת סיליקון במהירות של 500 RPMs למשך 10 שניות, ולאחריה 900 RPMs למשך 30 שניות, כדי להשיג ממברנה בעובי של 100 מיקרומטר. מכיוון ש-PDMS חדיר לגזים, ניתן להזרים חמצן לתוך המיקרו-תעלות ישירות דרך ממברנה זו. לאחר הכנת כל הרכיבים, כל משטח חיבור עובר טיפול בפלזמה של חמצן למשך דקה אחת.
באמצעות מכשיר פלזמה ידני, הצמד תחילה את ששת רכיבי המיקרו-תעלות למערך העמודים, ולאחר מכן נקב שני חורים בכל עמוד שישמשו כפתחי כניסה ויציאה של הגז. לבסוף, הצמד את הממברנה לתחתית המיקרו-תעלה כדי להקל על ההדבקה ולנקז בועות אוויר. את המשטחים שעברו טיפול בפלזמה לוחצים זה אל זה למשך כדקה באמצעות קצה של פינצטה; המתן שעה אחת בין כל פעולת הדבקה כדי להבטיח שהמכשיר מודבק לחלוטין וניתן לכיול.
לאחר שהמכשיר הושלם, יש לכייל את רמת החמצן שהתאים מקבלים בעת שימוש ברכיב החמצון (oxygenating insert) בניסויים בפועל. לצורך הכיול, השתמשו בחיישן חמצן פלואורסצנטי או ב-foxy slide, המכילים ציפוי של צבע רותניום פלואורסצנטי שעובר כיבוי (quenching) על ידי חמצן. ה-Foxy slides חתוכים מראש כדי להתאים לתחתית של פלטה בעלת שישה בארות (six well plate).
יש לחתוך את הזכוכית המכסה כך שתכסה חלק נרחב ככל האפשר מפני השטח של הבאר. מכיוון שלזכוכית המכסה יש עובי של כ-1 millimeter, יש להתאים את המכשיר כדי לשמור על המרחק הרצוי לצורך דיפוזיה נאותה של הממברנה.
מרחק זה תלוי בניסוי, אך ברוב המקרים הוא צריך להיות נמוך מ-one millimeter. באמצעות מכשיר פלזמה ידני, חתוך רגליים משקופית מיקרוסקופ מזכוכית בעובי one millimeter, באורך של כ-six millimeters וברוחב של four millimeters, והצמד אותן לתחתית המכשיר. המכשיר ינוח על הרגליים מעל השקופית.
ניתן להשתמש גם בלוחיות כיסוי מזכוכית עבור מרווח דיפוזיה של 0.17 millimeters כדי לתקף את צריכת החמצן. העבירו שלוש milliliters של מים דה-יוניזציה בטמפרטורת החדר אל בארות של פלטת שש בארות שבה יימדד החמצן. הניחו את המכשיר בפלטה ובאמצעות תוכנת metamorph, בחרו את מספר ומיקום העמדות הרצויות בחיישן ה-foxy.
החליקו את השקופית לבדיקת ריכוזי החמצן. חברו את צינורות ה-tai gun בין מיכל גז החמצן למכשיר ההחדרה ההיפוקסי. עבור בקרה מדויקת של הגז המסופק, נעשה שימוש בווסת זרימה מדויק המכוון לקצב זרימה של 50 עד 100 milliliters per minute.
יש לוודא שווסת הזרימה המדויק סגור. פתח תחילה את הווסת העליון של המכל, ולאחר מכן את הווסת המדויק. לאחר 15 דקות, הפחת את קצב הזרימה לטווח של 10 עד 20 לדקה.
כדי למנוע היווצרות בועות במים, יש לעקוב מקרוב אחר ערך קצב הזרימה במהלך השעה הבאה ולבצע התאמות לפי הצורך, כיוון שנפילת הלחץ תשתנה בעוד המערכת מגיעה לשיווי משקל, דבר שישנה את קצב הזרימה לצורך לכידת תמונות של הפלטה וחיישני ה-foxy. נעשה שימוש במיקרוסקופ Olympus IX 71 המצויד במערכת פלואורסצנציה, במצלמת CCD של Q Imaging Tiga, ובתוכנות לרכישת תמונות מסוג SRV ו-Metamorpho. המיקרוסקופ מצויד ב-Olympus 3 1 0 2 0, פילטר פלואורסצנציה תואם ל-foxy עם אורך גל עירור של 475 nanometers ואורך גל פליטה של 600 nanometers.
כדי לבחון את זמן ההגעה לשיווי משקל ואת מידת החמצון של המכשיר, בחרו שלוש נקודות על שקופית ה-foxy שבהן תמדדו את ריכוז החמצן. צלמו תמונה של השקופית מיד לפני תחילת זרימת הגז. צלמו תמונות במרווחים של 10 שניות במשך 30 דקות בזמן שהגז זורם דרך המכשיר, כדי לבחון את ההומוגניות ואת אספקת החמצן.
הגדירו נקודות רבבות במרווחים של מילימטר אחד לאורך רוחב התעלה, ומדדו את ריכוז החמצן על פני השטח של הבאר באמצעות metamorph. ייצאו את עוצמת התמונה הממוצעת עבור כל מיקום, ושרטטו את ריכוז החמצן כפונקציה של עוצמת הפלואורסצנציה. צרו עקומת כיול על ידי התאמת עקומות ליניאריות לקו שבין 0% ל-10% ולקו שבין 10% ל-21%, המקשרות בין עוצמת הפלואורסצנציה לריכוז החמצן. עבור כל מיקום שנמדד, ניתן לייצא נתוני עוצמה גולמיים מ-metamorph ולנתח אותם בהמשך באמצעות Microsoft Excel או תוכנה סטטיסטית אחרת.
לאחר כיול המכשיר, ניתן להתחיל בניסויים כגון בדיקות ריפוי פצעים; יש לבצע עיקור באוטוקלאב לרכיב המכויל בטמפרטורה של 121 °C למשך 15 דקות בתוך 24 שעות לפני הניסוי, ולהשתמש בו במabilis זרימה למינרית (laminar flow culture hood) כדי למנוע זיהום מאוחר יותר. השרו את רכיב ה-PDMS המעוקר בתווך ללא סרום למשך 24 שעות כדי למנוע היווצרות בועות גז בעת ההכנסה לבארי הפלטה; תרבתו תאי MDCK או תאים נצמדים אחרים עד להגעה ל-100% confluence בפלטה של שש בארות, וצרו שריטות ישרות בשכבות התאים החד-שכבתיות (monolayers) באמצעות טיפ של פיפט P 200. השריטות מדמות פצעים בשכבה החד-שכבתית הנצמדת.
שאבו את מצע התרבית של התאים ללא הפרעה לשכבה החד-שכבתית (monolayer) ושטפו עם חמישה מיליליטר של מצע. שאבו שוב ומלאו מחדש את הבארים בשלושה מיליליטר של מצע ללא סרום. הכניסו בעדינות את המכשיר אל הפלטה, תוך הקפדה להימנע מבועות.
הטיה של המכשיר במהלך ההחדרה מסייעת להוצאת בועות מצד אחד. יש להיזהר שלא להפעיל לחץ מופרז על המכשיר, שעלול לעוות את ה-PDMS במידה שתמעץ את התאים שמתחתיו. הנח את הפלטה ואת המכשיר על במה של מיקרוסקופ מחוממת ל-37 degree Celsius וחבר צינורות ממיכל הגז למכניס (inlet) ולמוצא (outlet) של המכשיר.
באינקובטור התרביות צריכה להיות חור המאפשר כניסת צינוריות, והצינוריות צריכות להיות מחוברות. לאחר הנחת המכשיר בתוך האינקובטור, בצע את אותו הליך להפעלת זרימת הגז כפי שתואר קודם לכן להערכת ריפוי פצעים. צלם תמונות time-lapse של התאים כל 20 דקות למשך 15 עד 18 שעות באמצעות הציוד ותוכנת ההדמיה שתוארו קודם לכן. ניתן להשתמש באלגוריתם למדידת שריטות (T scratch) כדי לנתח את שטח הפנים שטרם החלים לאחר משך הזמן הניסויי הרצוי. הפסק את זרימת הגז, הוצא את הצלחת והמשך בעיבוד תאים נוסף במידת הצורך. מכשיר המבואן ההיפוקסי דורש פחות משתי דקות כדי להתייצב ל-0.5% oxygen כפי שמוצג כאן.
גודל המרווח בתחתית באר ממבברת המכשיר היה גורם קריטי בקביעת יעילות השיווי המשקל, כאשר מרווחים גדולים יותר דרשו זמן רב יותר להגעה לערכי ריכוז חמצן במצב יציב. המכשיר מאפשר גם מידה רבה של שליטה על החמצון המרחבי בתוך באר אחת, דבר המאפשר יצירה של תנאים מרובים ואף יצירת פרופיל חמצן מחזורי על פני שטח הפנים של הבאר. שכבות מונו-שכבה של תאי MDCK נחשפו ל-10% או 21% חמצן, ושטח הפנים של הפצע נותח לאורך זמן באמצעות אלגוריתם מעקב אחר פצעי שריטה של MATLAB Ts.
לאחר 11 שעות מתוך 17 שעות סה"כ, נותר 6.87% מהפצע המקורי כאשר הוא נחשף ל-10% oxygen, בעוד ש-64.4% מהפצע נותרו תחת 21% oxygen. כפי שמוצג כאן, ריכוזי החמצן נמצאים במתאם שלילי עם שטח הפצע הפתוח עבור שני ריכוזי החמצן. למשך משך הניסוי, הרגשנו לכם כיצד לייצר, לתקף ולהשתמש בהתקן ההכנסה ההיפוקסי עבור בדיקת ריפוי פצע שריטה. ההתקן מציע מספר יתרונות על פני מערכות חמצון אחרות, כגון תפיסת מקום קטנה יותר במעבדה ושליטה רבה הרבה יותר בחמצון המרחבי והזמני על פני שטח התא.
ניתן להשתמש במכשיר כמעט בכל מעבדה החוקרת את השפעת החמצן או גזים אחרים, כגון פחמן דו-חמצני, על תרביות תאים in vitro. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשרות את המכשיר המעוקר ואת מצעי התרבית למשך לילה, כדי למזער את היווצרות הבועות במהלך הניסוי. בנוסף, יש לאפשר למערכת להגיע לשיווי משקל לפני תחילת הניסוי.
זאת משום שקצב הזרימה משתנה כאשר הלחץ במערכת מתאזן. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה דן בייצור ובתיקוף של התקן תשתית היפוקסי שנועד לשפר את השליטה על החמחמון בתרביות תאים בתוך פלטה בעלת שישה בארות. ההתקן מאפשר מניפולציה מרחבית וזמנית מדויקת של רמות החמצן, ובכך מקל על מחקרים בנושא השפעות החמצן על תהליכים ביולוגיים כגון ריפוי פצעים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסה ביומדיסית
- טכניקות לתרבית תאים
- בדיקות חמצון
רקע
- הבנת תפקידו של החמצן בתהליכים תאיים היא קריטית למחקרים ביולוגיים שונים.
- שיטות נוכחיות לאספקת חמצן בתרביות תאים הן לרוב מוגבלות.
- פיתוח של מכשיר חדש עשוי לשפר את תוצאות הניסויים.
- מחקר זה שואף לספק פתרון לבקרת חמצן טובה יותר in vitro.
מטרת המחקר
- ליצור התקן המאפשר בקרה משופרת של חמצון בתרביות תאים.
- לאמת את יעילותו של ההתקן בתנאים ניסיוניים.
- לחקור את השפעתם של רמות חמצן משתנות על ריפוי פצעים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור הרכיב ההיפוקסי באמצעות PDMS ופוטוליתוגרפיה.
- כיול אספקת החמצן באמצעות חיישנים פלואורסצנטיים.
- שימוש בבקר זרימה מדויק לאספקת גז.
- מדידת ריכוזי חמצן באמצעות מיקרוסקופיה ותוכנת דימיון.
תוצאות עיקריות
- המכשיר מצליח למזער את אורכי נתיב הדיפוזיה של אספקת החמצן.
- הוא מאפשר בקרה מדויקת על ההפצה המרחבית של חמצן בתרביות תאים.
- שיטות כיול אישרו את יעילות המכשיר באספקת רמות החמצן הרצויות.
- ניסויים הדגימו את השפעת החמצן על תגובות תאיות הקשורות לריפוי פצעים.
מסקנות
- מכשיר ההכנסה להיפוקסיה הוא כלי בעל ערך לחקר השפעות חמצן in vitro.
- הוא מספק לחוקרים יכולות משופרות לתכנון ניסויי.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכנולוגיה זו כדי לחקור תופעות ביולוגיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
בקרת חמצן מרחבית-זמנית מדויקת בתרביות תאים אדהרנטיות מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים הרגישים לחמצן במחקרי ריפוי פצעים ונדידה תאית. רכיב המבנה המיקרו-מיוצר זה משפר את הביטחון החזואי על ידי הפחתת מגבלות דיפוזיה ואפשרות ליצירת מדרגי חמצן הניתנים לשחזור או פרופילים מחזוריים. הוא תומך בתיקוף מטרות במודלים של מחלות המונעות על ידי היפוקסיה, בכך שהוא מספק פלטפורמה ניתנת להרחבה ולסטנדרטיזציה עבור תהליכי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות התלויות בחמצן בשכבות תאים צמודות (adherent monolayers).
- ערך תפעולי: מספק השמה מהירה (דקות ספורות) לסריקה של תנאים בתפוקה גבוהה.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי חיקוי תנודות פיזיולוגיות של חמצן in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת דפוסי חמצן מרחביים מדידים באמצעות תכנון רשת מיקרופלואידית.
- ערך תפעולי: שימוש בפוטוליתוגרפיה סטנדרטית של SU-8 ויציקה של PDMS להבטחת הדירות של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: התאמה לפלטות של שישה בארות המאפשרת בדיקה מקבילה של תנאים שונים בכל באור.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מדמה את דינמיקת החמצן בריפוי פצעים הנצפית בתיקון רקמות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מקשר בין ריכוז החמצן לבין מדדי הגירה ויצירת ROS.
- רלוונטיות פרה-קלינית: תוקף במנחרי MDCK עבור בדיקות סגירת פצעים תלויות-חמצן.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
המכשיר משלב שלבים החל מהגילוי המוקדם (בדיקת היפותזת החמצן), דרך פיתוח הבדיקה (אספקת חמצן הניתנת לשחזור), ועד לאישור פרה-קליני (תגובת ריפוי פצעים).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים באמצעות פרופילים זמניים מבוקרים של חמצן.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות באמצעות כיול עם חיישני חמצן פלואורסצנטיים.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות של חמצן באמצעות עקומות כיול של עוצמת פלואורסצנציה.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני באמצעות מדדי ריפוי פצעים בעלי רזולוציה מרחבית.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכנן לעיקור ולשימוש חוזר במחקרי מודולציה של חמצן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: הפחתת עמימות מכניסטית בתגובות תאיות התלויות בחמצן.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה באמצעות רכיבי PDMS המקושרים לפלזמה ותכנון ממברנה חדירה לגזים.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות של go/no-go באמצעות מדדי ריפוי פצעים ספציפיים לפרופיל החמצן.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות במסלולים מווסתים על ידי היפוקסיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של ליתוגרפיה רכה והדבקה בפלזמה.
- נחוצים ווסתי זרימה מדויקים וחיישני חמצן פלואורסצנטיים לצורך כיול.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של חיבורי צינורות הכניסה והיציאה של הגז.
- שיקולי התאמה כוללים את עובי הממברנה ואת המרחק בין העמודים לשליטה על הדיפוזיה.
- מגבלה מעשית: הימנעות ידנית מבועות במהלך ההחדרה משפיעה על ההדירות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:49
Introduction
1:21
Material Fabrication and Assembly of the Oxygenating Insert
3:57
Validation of Oxygenating Insert- Calibration, Heterogeneity and Equilibration.
7:45
Assembly of Oxygenating Insert for Wound Healing Cell Culture
9:56
Validating and Using an Oxygenating Insert in Monolayer Wound Healing
10:59
Conclusion
