דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

שלום, אני אריקה קגי מהמעבדה של שאנון פישר במחלקה לביולוגיה של התא והתפתחות באוניברסיטת פנסילבניה. אני כריס ובר, גם אני ממעבדתה של פישר. ואני שאנון פישר.

היום נדגים בפניכם פרוצדורה לניתוח התפקוד של אלמנטים מגבירים (enhancer elements) באמצעות טרנסגנזה בדגי zebrafish. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור רגולציה שקיפית של גנים החשובים להתפתחות השלד. אז בואו נתחיל.

כדי לזהות רצפים שאינם מקודדים הסובבים גנים מועמדים, אנו משתמשים באלגוריתם fast cons, הזמין כערוץ (track) בדפדפן הגנום של uc SC. אנו מתמקדים בעיקר בגנים המובעים במהלך התפתחות השלד, אך ניתן להשתמש בגישה דומה כדי לחקור כל גן המובע בשלבי התפתחות מוקדמים. בדוגמה המוצגת כאן, זיהינו רצפים שמורים.

במרווח הסובב את הגן bumper האנושי, אנו בוחנים את המרווח כולו עד לגנים הסמוכים וקובעים סף ניקוד לוגריתמי (log score) נמוך וספציפי לגודל, המקביל לכ-5% העליונים של הרצף שאינו מקודד. לאחר בחירת הרצפים, תוכנן פריימרים באמצעות Primer3 להגברה של כל רצף מ-DNA גנומי אנושי; יש לבחור פריימרים שיגבירו את האזור השמור בתוספת של 30 זוגות בסיסים או יותר מכל צד. הגבר את אזור העניין באמצעות פולימראז באיכות גבוהה תוך שימוש ב-DNA גנומי אנושי, והשתמש בנהלי ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיים במעבדה כדי לשבט את התוצר המוגבר אל תוך וקטור ביטוי.

הווקטור שבו נעשה שימוש בפרוטוקול זה הוא PG wc FOS GFPA gateway. ווקטור יעד (Destination vector). לאחר יצירת הווקטור, יש לבצע טרנספוזציה.

האנזים הדרוש לטרנספוזיציה מתומלל תחילה in vitro באמצעות ערכת M message M machine מבית Ambion והפלסמיד PGB 600 לפני ההזרקות הניסוייות. יש לבחון את היעילות של כל מנת טרנספוזים על ידי הזרקה עם מחזק ידוע, כגון mouse socks. 10 enhancer.

להכנה להזרקות, משוך את המחטים המשמשות למיקרו-הזרקה מzכלי זכוכית קפילריים בעלי קוטר חיצוני של 1.2 millimeter באמצעות מכשיר משיכת מיקרו-פיפט מסוג Sutter P 97. השתמש בתוכנית המניבה קצה חזק עם היטרויות חדה כדי לחדור דרך קוריון שלם בעזרת להב תער נקי וסנפליט מיקרומטרי. שבור את הקצוות ידנית תחת מיקרוסקופ סטריאומקרוסקופי עד לקוטר חיצוני של כ-15 micrometers.

ניתן לאחסן את המחטים למשך יום בצלחת אחסון מכוסה. יש לתחזק את אוכלוסיית דגי הזברה במחזור אור-חושך קבוע של 14 שעות אור בתנאים סטנדרטיים ביום שלפני ביצוע ההזרקות המיקרוסקופיות. הכינו את הדגים להכלאות מתוזמנות במיכלי רבייה קטנים.

הניחו שלוש נקבות או שני זכרים בכל מיכל בשורות מקבילות בבוקר ההזרקות המיקרוסקופיות, זמן קצר לאחר תחילת מחזור התאורה. שלבו זכרים ונקבות במים מטופלים של המערכת הנקייה לצורך הפקת ביצים. בדקו את הדגים בתדירות גבוהה ואספו את הביצים תוך דקות ספורות מההפקה כדי לקבל סדרות מסונכרנות היטב.

יש לשמור על ייצור הביצים במשך שעתיים עד שלוש שעות על ידי המשך שילוב קבוצות דגים טריות לאורך כל הבוקר, באמצעות פיפטת זכוכית רחבה בקוטר 5.25 אינץ' המצוידת בנורית לטקס. יש למיין את העוברים שנאספו לתוך צלחוני פטרי במידה של 60 על 15 מילימטר, הממולאים חלקית בתמיסת גידול לעוברים, בקבוצות של 50 עוברים. יש לסמן את זמן האיסוף על מכסה כל צלחון.

עבור כל מקבץ עוברים שנאסף, שמור מנה של 50 עוברים כביקורת ללא הזרקה בין איסופי הביצים. הכן תמיסות הזרקה טריות על ידי ערבוב הרכיבים הבאים במבחנה למיקרו-צנטריפוגה ושמור אותן על קרח. הנח את מחטי ההזרקה במ只能ות אחסון ומלא אותן ב-1.5 עד 2 µL מתמיסות ההזרקה.

על ידי טפטוף של 500 nanoliter על הקצה הרחב של כל מחט. הנוזל יימשך אל הקצה באמצעות פעולת נימיות. הכינו לפחות שתי מחטים עבור כל תמיסת הזרקה.

העמס את המחט הממולאת אל תוך מחזיק המחט הידני של משאבת pico פנומטית או מזריק לחץ דומה, המוגדר ומחובר למיכל חנקן בהתאם להוראות היצרן. כייל את נפחי ההזרקה על ידי מדידת קוטר הטיפות המופלטות אל תוך שמן מינרלי על שקופית מיקרומטר, בדרך כלל בזמן הזרקה של 120 milliseconds.

בלחץ של 20 PS, אפיק טיפה של כננוליטר אחד תוך שימוש במיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של 6 עד 10x. החזק את העובר במקומו באמצעות פינצטה עדינה ודחף את מחט ההזרקה בלחץ קבוע דרך הכוריון אל תוך החלמון של עובר בשלב תא אחד או שלב מוקדם של שני תאים; מקם את קצה המחט בחלמון ממש מתחת לבלסטומרים, פלוט כננוליטר אחד של תמיסת ההזרקה ונשוף את המחט. עבור כל מבנה (construct) נזריק ל-200 עוברים או יותר. לאחר השלמת ההזרקות, מיין את העוברים על ידי הסרת ביצים שלא הופרו, עוברים פגומים, הזרקות שנכשלו או עוברים ללא phenol red בבלסטומרים.

לאחר מכן אנו מדגירים את העוברים ואת מצע גידול העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C עד למועד התצפיות המתאים. כעת נציג בפניכם מספר תוצאות מייצגות של אלמנטים משפרי ביטוי (enhancer elements) המייצרים דפוסי ביטוי של GFP ספציפיים לרקמה בעובר דג הזברה. אנו חוקרים גנים המבטאים בעצם או בסחוס במהלך.

להלן דוגמה לאלמנט משפר (enhancer) שמעלה הגן acan, אשר מווסת את הביטוי בסחוס הפנים-גולגולתי שלושה ימים לאחר ההפריה. להלן משפר נוסף, הפעם מהגן bumper, המווסת את הביטוי בתאי עצם. בחמישה ימים, מתוך המשפרים הרבים שזיהינו, אנו מוצאים מתאם נמוך בין המיקום ביחס לגן לבין ויסות הביטוי.

בעת בחירת רצפים לבדיקה, חשוב לזכור שאלמנט מגביר (enhancer) יכול להימצא במרחק של מאות kilobases במעלה הזרם (upstream) או במורד הזרם (downstream) של הגן, או באחד האינטרונים, כפי שניתן לראות בעובר זה. חלק ניכר מהרצפים אינם נראים ככאלה המווסתים ביטוי ספציפי לרקמה. אלו לרוב מראים פלואורסצנציה נמוכה מאוד או עשויים להציג מספר תאים מפוזרים בשני אתרים נפוצים לביטוי אקטופי: האפידרמיס והשריר השלדי.

הרגע הדגמנו כיצד לזהות אלמנטים פוטנציאליים של מחזקים (enhancers) באמצעות שימור רצפים, וכיצד לבחון את תפקודם באמצעות טרנסגנזה פסיפסית (Mosaic transgenesis) בדגי zebrafish. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחון את איכות ה-DNA וה-RNA המשמשים להזרקה. כמו כן, יש לבחון בקפידה את כל העוברים המוזרקים, במיוחד אם מצופה ביטוי רק בקבוצה קטנה של תאים.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.