אבי העורקים צמצום רוחבי של עכברים
21 באפריל 2010
היצרות העורקים רוחבי (TAC) על העכבר הוא מודל ניסיוני נפוץ ללמוד המנגנונים היפרטרופיה לב ואי ספיקת לב הפיתוח. כאן אנו מתארים נהלים להתכווץ אבי העורקים כדי ליצור תואר לשחזור של היפרטרופיה לב בעכברים.
הליך זה מתחיל בהרדמת עכבר, הכנתו לניתוח אספטי והנחתו בתנוחת גב (supine) על פד חימום. אינטובציה אנדוטראכאלית מבוצעת באמצעות צינור PE 90, המחובר לאחר מכן למנשם למכרסמים. לאחר מכן, מבוצעת תורקוטומיה חלקית עד לצלע השנייה והסטרנום מודחק.
מזהים את האורטה הרוחבית (transverse aorta) ולאחר מכן קושרים אותה בין העורק הבלתי-שמי (innominate artery) לעורק התרדמה השמאלי. סוגרים את כלוב הצלעות, ולאחר מכן את העור באמצעות תפר רציף. לבסוף, מוציאים את צינור ההנשמה ומאפשרים לעכבר להתאושש.
שלום, אני אנגלה דאל מדה מהמעבדה של ד"ר זנדר וורס במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית וביופיזיקה ב-Baylor College of Medicine. היום נראה לכם את ההליך לביצוע היצרה של אבי העורקים (transverse aortic constriction) בעכברים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס היפרטרופיה של הלב והתפתחות אי-ספיקת לב.
בואו נתחיל. לפני תחילת הניתוח לחסימה רוחבית של אבי העורקים (transverse aortic constriction או TAC), חטאו את שטח הניתוח באמצעות 75% isopropyl alcohol. הדליקו את משטח החימום וכוון אותו לטמפרטורה הנכונה.
המערכת שאנו ממליצים עליה היא משאבת מים מחזרת המחוברת לרפידה לטיפול בחום הנשמרת בטמפרטורה של 37 פלוס או מינוס מעלה אחת Celsius. עקרו את הכלים הכירורגיים במכשיר עיקור בעגול חם (hot bead sterilizer) לפני הניתוח. עבור ההליך הכירורגי ב-tax, דרושים המכשירים הכירורגיים הבאים.
זוג מספריים קהים, שתי פינצטות עקומות גסות או פינצטות בזווית של 45 מעלות, זוג מספרי קפיץ זוויתיים, רטרקטור לחזה ומחזיק מחט. יש להכין גם מקלוני צמרון למקרה של דימום. לאחר הכנת שדה הניתוח, ניתן להמשיך לאינטובציה של העכבר.
כהכנה לאינטובציה, העכבר הרדמה בתא השראה ובעזרת מכונת גילוח מסירה את הפרווה מקו הצוואר ועד למרכז החזה. הנח את העכבר במצב שכיבה על הגב (supine) מעל למשטח החום. חשוב לשמור על טמפרטורת גוף רגילה במהלך הניתוח כדי למנוע ירידה מהירה בקצב הלב ומוות פתאומי אפשרי.
הפעילו לחץ על מיטת הציפורן של העכבר כדי לוודא שהעכבר נמצא תחת הרדמה מלאה. הצמידו גומייה מעל שיניו הקדמיות של בעל החיים כדי למתוח את הצוואר. בעזרת פינצטה קמורה ביד אחת, הזיזו בעדינות את הלשון הצידה בעזרת היד השנייה. הכניסו צינור PE 90 אל תוך הקנה.
בשלב הבא, חברו את הפחית האינטראטוראלי למנשם מכרסמים של Harvard הפועל במחזור נפח. המנשם צריך לפעול בקצב של 125 עד 150 נשימות לדקה ובנפח נשימה של 0.1 עד 0.3 milliliters, בהתאם למשקל הגוף של העכבר. חטאו את העור בתוך השדה הכירורגי באמצעות תמיסת Betadine ולאחריה אלכוהול 70%. חזרו על הליך זה שלוש פעמים כדי למנוע זיהום של השדה הכירורגי במהלך הניתוח. הניחו סדין סטרילי מעל העכבר, כך שרק שדה הניתוח יישאר חשוף.
אנו מוכנים כעת לבצע ליגציה של האורטה הרוחבית במהלך הליך כירורגי זה. ההרדמה מתוחזקת בריכוז של 1.5% עד 2% isof fluorine עם 0.5 עד ליטר אחד לדקה של 100% oxygen. יש לוודא את רמת ההרדמה הנכונה על ידי הפעלת לחץ על מיטת הציפורן של העכבר.
כדי לאשר את היעדרו של רפלקס הטוקן. התחילו את הניתוח בביצוע תורקוטומיה חלקית. חתכו את עצם החזה החל מהקצה הקרנייה ומטה עד לרמה של הצלע השנייה.
באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, הרחיבו את גרם העצם (sternum) באמצעות מקרב חזה (chest retractor). לאחר מכן, השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק בזווית של 45 מעלות כדי להפריד בעדינות את התימוס ורקמת השומן מקשת האאורטה. לאחר זיהוי האאורטה הרוחבית, מקמו פיסת חוט תפר משי 6.0 קטנה בין העורקים ה-denominate והקרטידי השמאלי.
קשרו שני קשרים רופפים סביב האורטה הרוחבית והניחו קטע קטן של מחט קהה במידה 27.5 במקביל לאורטה הרוחבית. הדקו במהירות את הקשר הראשון כנגד המחט, ולאחריו את הקשר השני, ולאחר מכן הוציאו מיד את המחט כדי להשיג היconstriction בקוטר של 0.4 millimeters.
לאחר שביצעו ליגציה של האאורטה הרוחבית (transverse aorta), הסיר את מפיש החזה וסגור את מוצא המנשם למשך שתי שניות. כדי לנפח מחדש את הריאות בזהירות, סגור את כלוב הצלעות באמצעות תפר proline 6.0 בתבנית תפרים נפרדים. לבסוף, סגור את העור באמצעות תפר proline 6.0 בתבנית תפר רציף.
עבור אלגזיה לאחר ניתוח. יש להזריק לעכבר בופרנורפין באופן תוך-פערי (intraperitoneal). אם מופיעים סימנים להתייבשות לאחר הניתוח, יש להזריק 0.3 עד 1 מיליליטר של תמיסת סליין סטרילית באופן תוך-פערי.
הפחיתו בהדרגה את ההרדמה עד למצב כבוי (off). כאשר יופיעו סימנים של נשימה ספונטנית, הוציאו את הפחית התת-קולטראי, לאחר מכן העבירו את העכבר למצב שכיבה על הבטן והניחו לו להתאושש על פדי חימום. שבוע לאחר היצרות האורטה הרוחבית (transverse aortic constriction), הרדימו שוב את העכבר כדי לקבוע את מידת עומס הלחץ שנוצר כתוצאה מההיצרות של האורטה הרוחבית.
ההרדמה וטמפרטורת הגוף נשמרות כפי שהודגם בעבר. הניחו probe דופלר של 20 megahertz בצדדים השמאלי והימני של הצוואר בזווית של 45 מעלות. כדי לזהות מהירויות זרימה בעורק הת צווארי (carotid artery), אנו משתמשים במעבד אותות דופלר מבוסס מחשב להצגה ואחסון של אותות הדופלר.
בהתאם לדרגת עומס הלחץ הנדרשת עבור הפרוטוקול הניסויי, רק עכברים עם יחס בין זרימה בעורק התקרותי הימני (RC) לזרימה בעורק התקרותי השמאלי (lc) בטווח מסוים נכללים לניתוח המשך. לדוגמה, דרגה מתונה של עומס לחץ מובילה ליחס של חמישה עד שמונה, בעוד שחישוק הדוק יותר הגורם לעומס לחץ חמור מוביל ליחס של שמונה עד 10. לעומת זאת, בבעל חיים קבוצת ביקורת (sham), היחס הצפוי הוא בערך אחד.
שיעור ההישרדות הכירורגית הטיפוסי לאחר TAC בעכברי פרא (wild type) הוא כ-80 עד 90%. קשירה כירורגית של האורטה הרוחבית תוביל ליחס במהירות זרימה בבדיקת דופלר בין העורקים הקרוטידיים הימני והשמאלי, או RC ביחס ל-lc, של חמישה עד 10 בהשוואה לעכברים שעברו ניתוח מדמה (sham).
הראינו לכם כיצד לבצע היצרות רדיאלית של אבי העורקים (transverse aortic constriction) בעכברים, אך בעת ביצוע פרוצדורה זו חשוב לשמור על טמפרטורת גוף רגילה ולמזער את איבוד הדם. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
היצרות רוחבית של אבי העורקים (TAC) בעכברים היא מודל כירורגי נפוץ לחקר היפרטרופיה של הלב ואי-ספיקת לב המושרות על ידי עומס לחצים. פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט, שלב אחר שלב, לביצוע TAC, הכולל הכנה טרום-ניתוחית, טכניקה כירורגית והערכה לאחר הניתוח. המודל מאפשר לחוקרים לדמות את התקדמות מחלות קרדיווסקולריות בבני אדם ולחקור את המנגנונים העומדים בבסיס השחזור (remodeling) של הלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פיזיולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם
- כירורגיה ניסויית
- מחקר על אי-ספיקת לב
רקע
- TAC גורם לעומס יתר של לחץ, המוביל להיפרטרופיה לבבית ולבסוף לאי-ספיקת לב בעכברים.
- המודל בעל הדירות גבוהה יותר והתקדמות הדרגתית יותר בהשוואה למודלים אחרים של אי-ספיקת לב, כגון חסימת עורק כלילי LAD.
- הוא נמצא בשימוש נרחב לחקר מסלולי איתות המעורבים בהיפרטרופיה ובאי-ספיקה לבבית.
- הערכת עומס הלחץ מתבצעת על ידי מדידת מהירויות זרימת הדם בעורק התהודי (carotid artery).
מטרת המחקר
- לספק שיטה הניתנת לשחזור להשראת היפרטרופיה של החדרי השמאלי ואי-ספיקת לב בעכברים.
- לאפשר חקירה של המנגנונים המולקולריים והפיזיולוגיים העומדים בבסיס רמיodeling לבבי.
- לסטנדרטיזציה של הערכת חומרת העומס בלחץ באמצעות מדידות זרימה בדופלר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמה טרום-ניתוחית והכנה אספטית של העכבר.
- אינטובציה אנדו-טרכאלית והנשמה מכנית.
- תורקוטומיה חלקית וחשיפה של האורטה הרוחבית.
- ליגציה של האורטה הרוחבית בין העורק האינומינאט לעורק התהCימי השמאלי באמצעות תפר משי ומחט בקוטר 27.5-gauge כדי להסדיר את קוטר ההיצרות.
- סגירת בית החזה והעור, מתן משככי כאבים לאחר הניתוח וניטור ההתאוששות.
- הערכה לאחר הניתוח של עומס לחץ באמצעות גשושון דופלר בתדר גבוה למדידת מהירויות הזרימה בעורקים התהCימיים הימני והשמאלי.
תוצאות עיקריות
- שיעורי הישרדות כירורגיים של 80–90% הם אופייניים לפרוצדורת TAC בעכברים מסוג wild-type.
- ליגציה מוצלחת יוצרת יחס מהירות זרימה בין העורק הקרוטיד הימני לשמאלי (RC/LC) של 5–10, המעיד על עומס לחץ בינוני עד חמור.
- בעכברים מתפתחת היפרטרופיה של הלב בתוך 1–2 שבועות ודילטציה של הלב לאחר 6–8 שבועות, בהתאם למידת הדחיסות של הקשירה.
- בעןים שעברו ניתוח Sham מראים יחס RC/LC של בערך 1.
מסקנות
- TAC היא שיטה יעילה הניתנת לשחזור להשראת היפרטרופיה של השריר הלבבי ואי-ספיקת לב בעכברים.
- טכניקה כירורגית מדויקת וטיפול לאחר הניתוח הם קריטיים להשגת שיעור הישרדות גבוה ותוצאות מהימנות.
- המודל מאפשר מחקרים מכניסטיים של התקדמות מחלות קרדיווסקולריות והתערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל של היצרות אבי העורקים הרוחבית (TAC) בעכברים מספק מערכת הניתנת לשחזור לחקר של היפרטרופיה של השריר הלבבי ואי-ספיקת לב המושרות על ידי עומס לחץ, ובכך מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות בתהליך גילוי תרופות למערכת קרדיו-וסקולרית. באמצעות יצירת דחק המודינמי מבוקר המדמה פתופיזיולוגיה אנושית, TAC תומך בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית במסלולים פרה-קליניים. מודל זה מגביר את רמת הביטחון החזויה לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) ולפיתוח ביומרקרים תרגומיים בטיפולים לאי-ספיקת לב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במסלולים של היפרטרופיה לבבית עקב עומס לחץ.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף תפקודי של מטרות במערכת הרלוונטית למחלה.
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרה של תהליכי איתות המעורבים בשינוי מבני לבבי (remodeling) maladaptive.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק מודל עכברי סטנדרטי לפיתוח בדיקות ולסריקת תרכובות במודלים של אי-ספיקת לב.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה כמותית הדירה של היפרטרופיה לבבית באמצעות יחסי מהירות זרימה בעורק התרדמי המופקים בשיטת Doppler.
- ערך מדעי: תומך בסריקה פנוטיפית על ידי יצירת פנוטיפים היפרטרופיים ודילטטיביים עקביים לאורך לוחות זמנים מוגדרים.
מחקרe טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע רלוונטיות למחלה על ידי חיקוי של לוחות הזמנים של התפתחות היפרטרופיה של שריר הלב וכשל לבבי בבני אדם.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני עם נקודות קצה המודינמיות מדידות.
- ערך מדעי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי מידול של מעבר הדרגתי מהיפרטרופיה מפוסה לכשל לבבי.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מודל ה-TAC משתלב ברצף הגילויים הקרדיווסקולריים, החל מבדיקת השערות על מטרות טיפוליות, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקרי יעילות פרה-קליניים, ובכך הוא תומך בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על בסיס תוצאות המודינמיות ופנוטיפיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים במנגנוני תגובה למעקה של הלב.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות השראה כירורגית סטנדרטית וכימות עומס לחץ מבוסס Doppler.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים (יחס מהירות זרימה RC/LC), המאפשרות השוואה של חומרת עומס הלחץ בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית באמצעות התקדמות זמנית מהיפרטרופיה לדילטציה, המשקפת את הפתופיזיולוגיה של אי-ספיקת לב באדם.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מטרות טיפוליות מרובות בפרויקטים של גילוי קרדיו-וסקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון בחיזוי של תיקוף המטרה באמצעות השראה הדירה של היפרטרופיה לבבית הנובעת מעומס לחץ.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והדירות באמצעות טכניקה כירורגית מוגדרת ותיקוף המודינמי באמצעות מדידות בגשש Doppler.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטאות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים, באמצעות הפחתת סיכון מכניסטית במודל פרה-קליני מתוקף.
- השפעה על פורט폴יו: תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, המבוסס על יעילותן בהחלשת היפרטרופיה הנגרמת מעומס לחץ והתקדמות הכשל הלבבי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות כירורגיות בעכברים, ניהול הרדמה וטיפול פוסט-אופרטיבי.
- הציוד הנדרש כולל מאוורר למכרסמים, גשש דופלר עם מעבד אותות, כלי מיקרו-כירורגיה ומסדי חימום לשמירה על הטמפרטורה.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת גודל היצרות כירורגית עקבי (0.4 mm) וספי דופלר (5-10 עבור עומס לחץ) בכל האתרים.
- שיקולי התאמה כוללים השפעות של רקע גנטי על התקדמות ההיפרטרופיה והשפעת מידת היצרות הכלי על חומרת הפנוטיפ.
- מגבלות מעשיות כוללות תמותה כירורגית (10-20%) ושונות במדידות דופלר הדורשת הכשרת מפעיל והקפדה על הפרוטוקול.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:42
Introduction
1:10
Preparing the Operating Field
2:02
Preparing and Intubation of Mice
6:31
Confirmation of Successful Ligation of the Transverse Aorta
3:25
Ligation of the Transverse Aorta
7:32
Results of a Successful Transverse Aortic Constriction
8:02
Conclusion
