Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס
22 באפריל 2010
אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.
סרטון זה מדגים פרוצדורה לעיבור וצביעה של תאי מונונוקלאריים מדם פריפרי (pbmc). לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה רב-צבעית, תאי pbmc שבודדו מדם מלא מוחדרים לצלחות תרבית רקמה. התאים מעובדים באופן כימי או ביולוגי כדי להשרות תגובה חיסונית.
בעקבות הגירוי, מוסיפים תערובת של נוגדנים כדי לזהות סוגי תאים על בסיס סמני שטח מובעים. לאחר מכן מבצעים פרמיאציה לתאים ומוסיפים תערובת אחרת של נוגדנים כדי לזהות ביטוי של ציטוקינים תוך-תאיים, ולאחר מכן התאים מנותחים באמצעות זרימה כדי לקבוע את פרופילי הציטוקינים עבור תתי-אוכלוסיות ספציפיות של pbmc. שלום, אני איימי קורטני מהמעבדה של ד"ר Jagan SAS במחלקה לאימונולוגיה במרכז הסרטן MD Anderson של אוניברסיטת טקסס.
שלום, אני Hong, גם אני מהמעבדה. היום נדגים לכם ניתוח ציטומטריה רב-צבעית של תגובות תאי T. אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור תגובות חיסוניות תאיות ב-Rhesus Macaque.
אם כן, נתחיל. התחילו פרוטוקול זה באמצעות שימוש ב-hemo cytometer כדי לקבוע את מספר התאים החיוניים של pbmc מ-Reuss Maca בשיטת exclusion של צבע Trian Blue. עבדו תחת מ 빠르게 למינאר (laminar flow hood) reus.
השעה את התאים במצע מלא בריכוז של 10 מיליון תאים למליליטר עבור גירוי לא ספציפי, על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 96 באערים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מצע המכיל PMA ו-CIN כדי להגיע לנפח כולל של 0.2 מליליטר, בריכוז סופי של 50 ננוגרם למליליטר PMA ו-500 ננוגרם למליליטר CIN; עבור באערי ביקורת שלילית, הוסף 100 מיקרוליטר של מצע מלא בלבד לכל באער. דגרי את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה מלחחית של 5% פחמן דו-חמצני למשך 1.5 שעות.
הוסיפו felden A לתרבית בריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter והדגירו למשך 4.5 שעות נוספות. ה-felden A מוסף כדי ללכוד cytokines במכשיר gold G להגברת הנראות בצביעה אימונית. לאחר הגירוי, סבבו בצנטריפוגה להסרת המצע ולאחר מכן שטפו על ידי הוספת 200 microliters של flow wash buffer קר וסבבו בצנטריפוגה במהירות נמוכה. חזרו על שטיפה זו, ולאחר מכן השאיבו ל-50 microliters של flow wash buffer.
התאים מוכנים כעת לצביעה עבור ביטוי של סמני שטח בכל באער של התאים שהושעו. הוסף 1 µL של צבע פלואורסצנטי תגובתי aqua fixable live dead שהוכן בהתאם להוראות היצרן. הדגר בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך 30 דקות בזמן שהתאים עוברים הדגרה.
הכינו במיקרו-טובות את תמיסאות הצביעה שישמשו לצביעה. ראשית, הכינו תערובת צביעה הכוללת את הרכיבים הבאים במינון המתאים: נוגדנים מונוקלונאליים המסומנים פלואורסצנטית לאחר תיחור, anti CD three PE SCI seven, anti CD eight Alexa 700, anti CD 28 per CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC ו-anti CD four Pacific Blue, בתוך Inflow Wash Buffer.
בשלב הבא, הכינו בקרים לפיצוי, אשר ישמשו לקביעת מקדמי הדילילה (spillover) של כל צבע בודד לגלאים אחרים, וזאת על ידי הכנת מבחנה של כל נוגדן מצומד פלואורסצנטית כצבע בודד. לבסוף, הכינו צביעות של פלואורסצנציה פחות אחד, או FMO, על ידי שילוב כל הרכיבים למעט הרכיב הנבדק. אלו ישמשו לקביעת הגבול בין אוכלוסייה חיובית לשלילית, על ידי שכפול רמות האוטופלואורסצנציה והנתונים הקיימים בדגימות צבועות באופן מלא.
לאחר דגירת התאים בצבעיות חיות/מתים (live dead stain), שטפו אותם פעם אחת עם בופר שטיפה קר לזרימה (flow wash buffer) כדי להסיר עודפי צבע, ושאבו את בופר השטיפה. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסות הצביעה שהוכנו. דגרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C בחשכה למשך 30 דקות.
שטפו את התאים הצבועים בבופר שטיפה קר לזרימה (flow wash buffer) כדי להסיר נוגדנים עודפים. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת קיבוע וחדירה (fixation permeation solution) של BD למשך 10 דקות לפחות. שמרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך עד 24 שעות עד לשימוש בהם, או המשיכו לשלב סימון הציטוקינים התאיים כדי לסמן ציטוקינים תאיים.
ראשית, בצעו פרמיאציה לתאים ב-100 µL של 1X perm wash buffer. דגרו למשך 10 דקות ב-4 °C בחושך בזמן שהתאים עוברים דגירה. הכינו את הנוגדנים לצביעה, את בקרות הפיצוי (compensation controls) ואת בקרות ה-FMO ב-1X perm wash buffer כפי שנעשה קודם לכן.
לאחר דגירה של התאים למשך 10 דקות, סובב במצנטריפוגה והסר את ה-one x perm wash buffer. הוסף את הנוגדנים המתאימים לצביעה. לאחר מכן, דגור את התאים והנוגדנים למשך 60 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius בחושך.
שטפו את התאים פעמיים בתמיסת החדירה. לאחר השטיפה האחרונה, השעו את התאים ב-1% Paraformaldehyde ב-DPBS כדי לקבע אותם. אחסנו את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימושם, למשך תקופה של עד 24 שעות.
לאחר צביעת התאים, השתמשו בציטומטר זרימה LSR II או בציטומטר זרימה CytoFLEX כדי לבצע FACS. לאחר מכן, נתחו את הנתונים באמצעות FlowJo או תוכנה דומה. הרכב ה-PBMC ב-rhesus maca נקבע באמצעות אנליזת FACS.
איור זה מציג את סכימת ה-gating ששימשה לניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T מבעל נסויי מייצג. תחילה בוצע gating ללימפוציטים באמצעות פיזור קדמי FSC לעומת פיזור צדי SSC, ולאחר מכן זוהו לימפוציטים חיים על בסיס SSC ואוכלוסייה שלילית ל-AQUA. תאי ה-T זוהו על ידי ביטוי של CD3; כמו כן, נקבעו אוכלוסיות של CD4 חיובי ו-CD8 שלילי, וכן CD4 שלילי ו-CD8 חיובי בתוך אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים ל-CD3.
תאי T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD8 הובחנו בהמשך לתתי-אוכלוסיות שונות על בסיס ביטוי של CD28 ו-CD95, כתאים נאיביים, תאי זיכרון מרכזיים ותאי זיכרון אפקטוריים. איור זה מציג ייצור של interferon gamma ו-IL-2 בתאי T חיוביים ל-CD4 ובתתי-אוכלוסיות שלהם, במצב לא מעורר ובמעוררי pma ו-CIN.
שימו לב לפרופילי הציטוקינים המובחנים שהופעלו בעקבות הגירוי. בכל תת-אוכלוסייה. נדגים לכם כיצד לבצע אנליזת ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית (multi flow cytometry) של pbmc.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין הן בקרות פיצוי של צבע בודד והן בקרות Fluorescent Minus One (FMO). שתי הבקרות הללו נחוצות לצורך ניתוח תקין של נתוני ציטומטריה זרימה. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב שלנו למידע נוסף על בחירת בקרות פיצוי.
כמו כן, אנא זכרו כי בעת שימוש בנוגדן מסומן פלואורסצנטית, חשוב לכסות את הדגימות כדי להגן עליהן מחשיפה לאור. זהו כל הסיפור. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים פרוצדורה לעירור וצביעה של תאים חד גרעיים של דם פריפרי (PBMC) לצורך אנליזה בציטומטריה זרימה רב-צבעית. המחקר מתמקד באפיון פנוטיפי ותפקודי של תתי-אוכלוסיות של תאי T מסוג CD4+ ו-CD8+ בקוף מקאק רזוס, המשמש כמודל למחקר חיסונים נגד HIV/AIDS.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ציטומטריית זרימה
- מחקר HIV/AIDS
רקע
- מקאקים מסוג רזוס משמשים כמודל לחקר HIV/AIDS.
- הבנת תתי-אוכלוסיות של תאי T היא קריטית לפיתוח חיסונים.
- ציטומטריית זרימה רב-צבעית מאפשרת ניתוח מפורט של תאי מערכת החיסון.
- תאי PBMC הם מרכיבים מרכזיים בחקר תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- לאפיין תתי-אוכלוסיות של תאי T כולל ותאי זיכרון.
- להשתמש בציטומטריית זרימה רב-צבעית לצורך פרופיל חיסוני מפורט.
- להעמיק את ההבנה של תגובות חיסוניות בהקשר של HIV/AIDS.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד PBMC מדם מלא.
- סטימולציה כימית או ביולוגית של PBMCs.
- שימוש בתערובות נוגדנים לזיהוי סוגי תאים וסמני שטח.
- ניתוח פרופילי ציטוקינים באמצעות ציטומטריית זרימה.
תוצאות עיקריות
- סטימולציה וצביעה מוצלחות של PBMCs לצורך אנליזה.
- זיהוי של תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאי T על בסיס סממני שטח.
- אפיון של ביטוי ציטוקינים תוך-תאיים.
- תובנות לגבי תגובות חיסוניות הרלוונטיות ל-HIV/AIDS.
מסקנות
- ציטומטריית זרימה רב-צבעית יעילה לניתוח תאי T.
- קוף רזוס מספק תובנות בעלות ערך למחקר על חיסונים ל-HIV.
- הבנת הדינמיקה של תאי T חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ציטומטריית זרימה רב-צבעית מאפשרת אפיוס פנוטיפי ותפקודי מדויק של תתי-אוכלוסיות של תאי T בקוף רזוס, המהווה מודל פרה-קליני קריטי לפיתוח חיסונים נגד HIV. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי כימות תגובות חיסוניות המייצרות ציטוקינים, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי על ידי קישור של גרייה ספציפית לאנטיגן לפלטי ציטוקינים תוך-תאיים מדידים באוכלוסיות זיכרון מוגדרות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידת ייצור של IFN-γ ו-IL-2 בתתי-אוכלוסיות של תאי T מסוג CD4+ ו-CD8+ לאחר גרייה.
- ערך תפעולי: מספק מדדים איכותיים וכמותיים של ביטוי ציטוקינים תוך-תאיים כדי להפחית את העמימות המכניסטית בתהליך התיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי רגיש של פראקציות קטנות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בדגימות PBMC מבעלי חיים מחוסנים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי ביסוס פרוטוקולי צביעה וגירוי סטנדרטיים לצורך פרופיל חיסוני הניתן לשחזור.
- ערך תפעולי: מענה לסוגיית הסטנדרטיזציה והשחזור של הבדיקה באמצעות שימוש בביקורות פיצוי (compensation controls) ובביקורות FMO להבטחת הגדרה מדויקת של אוכלוסיות התאים (gating).
- ערך מדעי: הדגשת המוכנות לסריקה על ידי מתן אפשרות לגילוי פרופילי ציטוקינים בתתי-אוכלוסיות של תאי T נאיביים, תאי זיכרון מרכזיים ותאי זיכרון אפקטורים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי התאמת מדידות של ציטוקינים תוך-תאיים בקוף רזוס (rhesus macaques) עם הפתוגנזה של HIV ותגובות חיסוניות המושרות על ידי חיסון.
- ערך תפעולי: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור תוצאות גירוי של PBMC לאפיון תפקודי של תאי T.
- ערך מדעי: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חזויה על ידי שימוש בייצור ציטוקינים כקריאה תפקודית להערכת אימונוגניות של חיסון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה ממוקמת בתוך רצף הגילוי, החל מאפיון חיסוני ראשוני ועד לזיהוי מובילים (leads), ותומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים במודלים של מחלות זיהומיות.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות על ידי כימות ייצור ציטוקינים בתתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאי T בעקבות גרייה באמצעות PMA/ionomycin או גרייה ספציפית לאנטיגן.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות גרייה סטנדרטית, צביעה של פני השטח וצביעה תוך-תאית, וניתוח ציטומטרי של זרימה (flow cytometric) של דגימות PBMC.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון תדרי ייצור של IFN-γ ו-IL-2 המאפשרות השוואה של תגובות חיסוניות בין תנאים ותתי-אוכלוסיות שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה להמשכיות פרה-קלינית על ידי קישור תגובות תאי T המושרות על ידי חיסון בקוף רזוס (rhesus macaques) לפרופיל חיסוני תפקודי הרלוונטי לפיתוח חיסון נגד HIV.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר עבור ניטור חיסוני אורכי לאורך מועמדים שונים לחיסונים ופורמולציות של חומרים מסייעים (adjuvants).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרות והפחתת עמימות מכניסטית בתגובות חיסוניות המתווכות על ידי תאי T.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של בדיקות ציטומטריה של זרימה רב-צבעית לאפיון חיסוני.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות פיתוח חיסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על פרופילים כמותיים של ציטוקינים במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בתכנון פאנלים לציטומטריה של זרימה, פיצוי (compensation) ואסטרטגיית gating לצורך אימונופנוטיפינג רב-צבעי.
- צרכים של תשתית מכשורית ואנליטית, כולל ציטומטר של זרימה (למשל, LSR II) ותוכנה (למשל, FlowJo) לניתוח נתונים רב-ממדיים.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור תנאי גירוי, טיטרציה של נוגדנים והגדרת ביקורות (צבע בודד ו-FMO) בין מעבדות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, כולל אופטימיזציה של ריכוזי גירוי וזמני אינקובציה עבור PBMC מפרימטים שאינם אדם.
- מגבלות מעשיות הנתמכות בחומר המקור: הצורך בהגנה מאור עבור נוגדנים פלואורסצנטיים וביצוע טיטרציה מדויקת כדי למזער spillover בפאנלים רב-צבעיים.
