כריסטופר יוז: במודל חוץ גופית לחקר אנגיוגנזה (ראיון)

שלום, שמי ד"ר כריסטופר יוז (Christopher Hughes). אני פרופסור באוניברסיטת קליפורניה אירביין, והמעבדה שלי חוקרת את תהליך האנגיוגנזה. אנו מתעניינים במיוחד בגנים המווסתים את תהליך האנגיוגנזה.

ביצענו אופטימיזציה לבדיקות in vitro המבוססות על עבודתם של נלסון ועמיתיו, ובבדיקה זו אנו יכולים לבחון את כל התהליכים השונים המתרחשים במהלך אנגיוגנזה. אנו מצפים חרוזי tedex, חרוזים קטנים, בתאי אנדותל. לאחר מכן אנו מטמיעים אותם בג'לי פיברין ומספקים גורמי גדילה.

ובמהלך מספר ימים, התאים האנדותליאליים נבטים מהחרו지를. הם נודדים, מסתדרים, שוכפלים, יוצרים צינורות, מתבסעים ויוצרים אנסטומוזיס. כך שבערך לאחר 10 ימים מתקבלת בתרבית רשת שלבוליים שלמה.

ובכן, חלק מהבעיות בבדיקות angiogenesis ו-envivo, לדוגמה אלו המבוצעות בעכברים, הן שהמערכת אינה קלה למניפולציה. קשה להדמיז ויזואלית את התהליכים המתרחשים בתוך בעל חיים, שכן לא ניתן באמת לראות את ה-angiogenesis קורה. לעומת זאת, כאשר רוצים לבצע מניפולציה במערכות תרביות in vitro שלנו, קל מאוד לבצע מניפולציה גנטית לתאי האנדותל, להפעיל או לכבות גנים, ולבחון את ההשפעות של פעולות אלו על sprouting angiogenesis.

וזה הרבה יותר קשה לביצוע בבעל חיים שלם. עליך ליצור Knockouts או Knockins. לכן, אלו הם שני היתרונות המרכזיים.

קל לתמרן אותו וקל להדמיאו חזותית. לכן, לאורך השנים פותחו מספר בדיקות שונות להיווצרות כלי דם (angiogenesis) במבחנה (in vitro), ולכל אחת מהן יש יתרונות וחסרונות. ובפרט, בדיקה ידועה היא בדיקת ה-matrix gel, שבה תאי אנדותל מונחים על גבי מטריצה חוץ-תאית הנקראת matrigel.

והבעיה שם היא שהתאים האנדותליאליים יוצרים מבנים דמויי חבלים, אך הם מעולם לא יוצרים כלי דם בעלי לומן תקין. לא רואים ניתוצים (sprouting) ולא רואים אנסטומוזיס. קיימים מודלים של ג'ל קולגן, שיכולים להיות יעילים.

ישנם רבים מאלו שבהם לא רואים פרוליפרציה של תאי אנדותל. בדרך כלל לא רואים אנסטומוזיס. בדיקת ג'ל הפיברין שפיתחנו מבוססת על מודל של Nelson Kar שפורסם באמצע שנות התשעים.

וכעת שיפרנו זאת באופן משמעותי כך שניתן לראות את כל שלבי האנגיוגנזה. אנו יכולים לצפות בניבט הראשוני, בנדידה. אנו רואים פרוליפרציה של תאים, אנו רואים היווצרות של לומן, אנו עדים להסתעפות, ובסופו של דבר אנו מקבלים אנסטומוזיס ליצירת רשת כלי דם מלאה in vitro.

לפיכך, אנו מאמינים שבדיקה זו היא המערכת האין ויטרו (in vitro) הטובה ביותר שקיימת אם ברצונך לבחון את כל השלבים השונים של אנגיוגנזה. יתרון נוסף של בדיקה זו במערכת אין ויטרו הוא היכולת לבצע מיקרו-דיסקציה בשבי capture לייזר; אנו יכולים לסבוב את התרבית כך שתהיה שטוחה מאוד, ואז להשתמש במיקרוסקופ למיקרו-דיסקציה בשבי לייזר. אנו יכולים למעשה להוציא תאים בודדים, ובמיוחד אנו מעוניינים בתאי הקצה (tip cells).

לכן אנו גוזרים אותם וניתן לבחון את הביטוי הגני, במיוחד בתאי הקצה לעומת תאי הגו, התאים שיוצרים בפועל את הלומן. ההיפותזה שלנו היא שיהיה ביטוי גני שונה בין שתי אוכלוסיות תאים אלו. אנו יכולים לבחון זאת, שכן הדבר היה כמעט בלתי אפשרי לביצוע במערכת in vivo.

לכן אנו סבורים שזהו יתרון מרכזי נוסף של שימוש במערך בדיקה (Assay) מסוג זה in vitro. בעבודות המוקדמות שנעשו בנושא, כפי שציינתי, על ידי Nelson Recon, נעשה שימוש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים. קיימת תפיסה רחבה כי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים הם התאים שיהיה רצוי להשתמש בהם לבדיקה כזו, מכיוון ש-in vivo, תאי ה-EC המיקרו-וסקולריים הם אלו שבאמת יוצרים כלי דם חדשים.

החלטנו לנסות לבצע זאת עם תאי ווריד טבילית אנושיים (HUVECs). בחרנו בתאים אלו ממספר סיבות, שאחת מהן היא שהם קלים מאוד להשגה.

ניתן לגשת לבית החולים, להשיג חבלי טבור מחדרי הלידה, ולבודד את התאים בקלות רבה. כמו כן, תאים אלו משמשים לתרביות במשך שנים רבות והם מאופיינים היטב.

לפיכך, הקמנו את הבדיקה הזו וביצענו לה אופטימיזציה כדי שנוכל להשתמש בתאים אלו מהסיבות הללו. באופן מעניין, מתברר שתאי אנדותל של כלי דם גדולים נוטים לאמץ בתרבית את צורתם של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים. הם מאבדים ביטוי של גנים רבים המובעים בדרך כלל על ידי תאי אנדותל של כלי דם גדולים, ומתחילים לבטא גנים הקשורים בדרך כלל לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים.

והם בעלי יכולת מלאה להניב נבטים דמויי נימיים, ליצור לומינים (lumens) וליצור מבנים שנראים בתרבית בדיוק כמו נימים אמיתיים. לכן, הם קלים לשימוש, והם עושים את מה שאנו רוצים שיעשו. הם מנביטים, והם יוצרים כלי דם בעלי לומן תקין.

כאשר אנו מעוניינים לכמת את הבדיקה הזו, ישנן למעשה מספר דרכים שבהן ניתן לפעול. אנו יכולים לבחון קריטריונים כמותיים כגון מספר הנבטים, אורך הנבטים, קוטר הנבטים, מספר נקודות ההסתעפות ומספר האנסטומוזות, אך אנו בוחנים גם קריטריונים איכותיים. לפיכך, אנו יכולים לבחון האם הם יוצרים לומנים?

וזה ככל הנראה מה שמעניין אותנו ביותר. בהרבה מהבדיקות שאנו מבצעים, מדובר ביצירה תקינה של הלומן (lumen). מדובר למעשה בהערכה איכותית יותר, אם כי ככל שהכלי דם גדל, ניתן למעשה למדוד גם את קוטרם של הלומנים הללו.

לכן אנו משתמשים בפיברובלסטים בתרביות אלו. אנו מטמיעים את החרוזיים בתוך ג'ל פיברין וזורעים פיברובלסטים מעל הג'ל. הפיברובלסטים חיוניים לחלוטין להנבטה תקינה וליצירת לומינה.

בהיעדר פיברובלסטים, אנחנו מקבלים מידה מסוימת של ניבוב (sprouting). עם זאת, התאים האנדותליאליים נוטים שלא להישאר מחוברים זה לזה. מה שקורה הוא שהם נודדים רחוק זה מזה.

לכן, כל מבנה שמתפתח על נבט זה נוטה להתפרק. ולאחר מספר ימים, התאים האנדותליאליים עוברים אפופטוזיס. נראה שפיברובלסטים מייצרים גורמים החיוניים לאנגיוגנזה, לפחות במערכת in vitro זו.

והיינו מעוניינים מאוד לדעת מהם הגורמים הללו. מה שמצאנו הוא שהפיברובלסטים מפרישים משהו למצע, כך שניתן לקחת מצע מותנה (conditioned medium) מהפיברובלסטים וזה יתמוך בהניצה ובבניית הלומן בצורה תקינה. לפיכך, אנו בהחלט עוסקים בגורם מסיס.

לכן, אנו מעוניינים מאוד לדעת מהם החומרים שהפיברובלסטים מייצרים, אשר כה חיוניים לאנגיוגנזה במערכת זו. בדקנו את כל הגורמים המוכרים; VEGF ו-basic FGF נמצאים בתרבית, והוספה של כמויות נוספות אינה מהווה תחליף לפיברובלסטים. בדקנו גם את angiopoietin one, TGF beta, HGF וכן הלאה.

עד כה לא מצאנו את הגורם המכריע. לכן, כעת אנו מנקים גורמים מתוך מדיום מותנה של פיברובלסטים. אנו מעבירים את המדיום המותנה דרך עמודות שונות, חילוף קטיונים והדרה גודלית, ומקבלים פרקציות בעלות פעילות.

כעת אנו עוקבים אחר פעילות זו ולוקחים את הפראקציות, כדי למצוא אילו מהן פעילות, ומשם נוכל להריץ אותן על ג'לים, לוודא שיש לנו מספר קטן יחסית של פסים על הג'ל, ואז נוכל לגזור אותם ולהעבירם לריצוף באמצעות mass spec. וזה מספק לנו נתונים מעניינים מאוד. כעת יש לנו מספר גנים מועמדים שאנו בודקים באופן פרטני כדי לראות אם הם אכן הגורם שאותו אנו מחפשים.

בחנונו גורמים אנגיוגניים ידועים רבים, וידוע כי VEGF ו-basic FGF חיוניים למעשה להנבטה תקינה במערך זה. אך הם אינם הסיפור המלא. ישנם גורמים נגזרים שחשובים, כפי שציינתי, ואחת הדרכים שבהן בחנו זאת היא על ידי שימוש בתאי גידול, שהם אנגיוגניים מאוד in vivo, הם יוצרים גידולים גדולים בעכברים והם בעלי וסקולריזציה גבוהה.

ובחנו את תאי הגומא הללו, והם מבטאים רמות גבוהות מאוד של vegf, והכנסנו אותם לתרביות שלנו. כך החלפנו את הפיברובלסטים בתאי הגומא הללו, והם אינם תומכים בענגיוגנזה רבבית בבדיקה זו. וזה מעניין מאוד.

מה שזה מרמז, וכך נטענו גם על ידי אחרים, הוא שקיים קשר הדדי (crosstalk) בין הגידול, הסטרומה (stroma), הכוללת את הפיברובלסטים ותאי תמיכה אחרים ברקמה, לבין התאים האנדותליאליים. ייתכן מאוד שתאי הגידול מייצרים גורמים הפועלים ישירות על התאים האנדותליאליים, אך הם מייצרים גם גורמים אחרים המעוררים את הפיברובלסטים ותאי סטרומה אחרים לייצר גורמים שתומכים בעקביות ב-Angiogenesis נמרץ.