קביעת ריאקטיביות Titre של סרום באמצעות Assay Haemagglutination

קביעת התגובתיות והטיטר של סרום באמצעות בדיקת המגלוטינין. הגלוטינציה היא תגובה המתרחשת בין נוגדנים מסיסים לבין אנטיגנים חלקיקיים. אלו יכולים לכלול תאים או מולקולות נשאות.

אפיטופים על פני השטח של הנשא מאפשרים לנוגדן להיקשר ולהקשר את הנשאיים יחד, דבר המוביל להיווצרות סריג מורכב הנקרא קומפלקס נוגדן-אנטיגן. המגלוטינציה של כדוריות דם אדומות (Hem agglutination) היא צורה ספציפית של הגלוטינציה שבה נוגדנים נקשרים לתאי דם אדומים, המשמשים כאנטיגן החלקיקי. תאי דם אדומים הם מטרות שימושיות מכיוון שהם זמינים במידה רבה והתוצאות ניתנות לצפייה בקלות בעין בלתי מזוינת.

מדגמי סרום מדללים בסדרת דילול ולאחר מכן מוכנסים לצלחת U-bottom בעלת 96 בארות. לאחר מכן מוסיפים תרחיף של תאי דם אדומים. כאשר נוכחים נוגדנים בריכוז גבוה, מתרחשת קישור לתאי הדם האדומים, דבר היוצר רשת גדולה.

כאשר סריג זה שוקע כתוצאה מכוח הגרוויטציה, הוא מתאים את עצמו לצורת פלטת ה-ubo. במבט מלמעלה, נראה גליון רחב של תאי דם אדומים. זוהי תגובת המגלוטינין חיובית.

כאשר רמות הנוגדנים נמוכות, לא נוצר סריג ותאי הדם האדומים מקבלים את צורתו של לוח ה-UBO ומתרכזים בבסיסו תוך יצירת משקע קטן. זוהי תגובת המגלוטינציה שלילית. דיאגרמה זו מציגה תגובה חיובית.

התאים יוצרים סריג בעודם שוקעים, והם נצמדים לצורתו של תחתית הלוח בצורת U. משמאל ומימין, אנו רואים מבט מלמעלה שבו נראה גילי רחב של תאי דם אדומים. אם קיימת כמות בינונית של נוגדנים, ייראו תצורות דמויות אותיות.

הגלוטינציה של כדוריות דם מאפשרת גם לבחון את התגובתיות של דגימות סרום שונות כנגד האנטיגן הידוע. כמו כן, ניתן לקבוע את הטיטר של דגימת הסרום, כאשר הטיטר הוא הדילול האחרון שבו נצפתה תגובה חיובית.

בדרך כלל, ככל שריכוז הנוגדנים בדגימת הסרום גבוה יותר, כך הטיטר גבוה יותר. תרשים זה מראה תגובת המגלוטינציה שלילית. כמות הנוגדנים הנוכחת אינה מספיקה ליצירת קשרי צלב בין כדורי הדם האדומים.

בעוד התאים שוקעים כתוצאה מכוח הכבידה, הם מחליקים במורד דופן הבאר ויוצרים משקע (pellet) הדוק בתחתית. הדיאגרמה מימין מציגה את תאי הדם האדומים כפי שהם נראים במבט מלמעלה. עבור ניסוי זה, תזדקקו לפלטה אחת בעלת 96 בארות עם תחתית בצורת U.

חיוני להשתמש בלוחית בעלת תחתית בצורת U, כיוון שלוחותית בעלת תחתית שטוחה לא תאפשר לתאים לשקוע למשקע, דבר שיהפוך את הפרשנות לבלתי אפשרית. פפטה המסוגלת להעביר 50 µL של סרום, תמיסה של 1% של תאי Riva ותמיסת PBS אחת לכל באר בשורה. לכל באר בטווח שבין 1 ל-12, העבירו 50 µL של PBS.

זה משמש כמדלל שלך. כעת העבר 50 µL של סרום לבבור A1. זהו הדילול הראשון שלך ביחס של 1:2.

באמצעות הפרפט (perpet), ודא שדגימת הסרום מעורבבת היטב. לאחר הערבוב, העבר 50 µL מבאר A1 לבאר A2. זהו הדילול השני שלך ביחס של 1:2, מה שנותן דילול של פי ארבעה.

המשיכו את סדרת הדילול זו באמצעות בארות 3 עד 11. אל תניחו סרום בבאר 12, שכן זוהי בקרת השלילה שלכם ב-roal buffer saline. כעת קחו את תמיחת ה-Riva cells בריכוז 1%, לאחר שערבבתם אותה היטב, והעבירו 50 µL לבארות A1 עד A12.

לאחר הוספת התאים, כסו את הפלטה והקישו עליה בעדינות כדי להבטיח ערבוב של הדגימות והתאים. כעת דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות. דגירה באינקובטור לח היא מתאימה.

במהלך תקופת הדגירה של 60 דקות, יתרחשו אינטראקציות בין אנטיגן לנוגדן והתאים יתחילו לשקוע. סרטון הווידאו שאתם צופים בו הוא צילום השהיה (time lapse) של כל תקופת ה-60 דקות. זוהי תצוגה מקربة של בארות 5 עד 10.

כבר בחנו את באר 12, שהייתה בקרת ה-VBS שלכם בניסוי זה. ניתן לראות כי התאים יצרו משקע הדוק, מה שמעיד על כך שהבדיקה תפקדה כראוי. בארות חמש ושש הן דוגמאות להמגלוטינציה חיובית.

ובכן, באר שבעה היא דוגמה לתוצאה ביניים של אגלוטינציה, בעוד שבארה שמונה, תשע ועשרה התוצאה להמגלוטינציה היא שלילית. על סמך תוצאה זו, התר יקבע לפי הדילול עבור באר שבעה, שכן זו הייתה הבאר האחרונה שבה נצפתה תגובה חיובית.