ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לגידול והרחבה של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מתוך מקטעים ברונכיאליים אנושיים שבודדו טריים. פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים: קידוד וגירוד, צלחות תרבית של מאה מילימטר, תיקון רקמה ברונכיאלית, השתלות של רקמה ברונכיאלית שהוצאה (explan), מעבר של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים הגדלים עם ריססים, ותאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים על transwells. לפני שתתחילו, שימו לב שכל השלבים מבוצעים במCאבט בטיחות ביולוגית.

אלא אם צוין אחרת, אנא קראו את סעיף החומרים, הריאגנטים וההכנה וודאו כי התכוננתם כראוי. השלבים הבאים של קידוד, תרביות של תמיסות מלאי, תמיסות פירוק של מדיום, ציפוי ושריטות, בצלחות תרבית של 100 מילימטר, צריכים להתבצע ב-bst.

שמרו על סטריליות מלאה. הכינו פלטות תרבית סטריליות של 100 מילימטר ותמיסת ציפוי. בעזרת פפיט BST, העבירו 2 מיליליטר של תמיסת ציפוי לפלטה של 100 מילימטר וסובבו אותה כדי לצפות את בסיס הפלטה.

ודאו שתמיסת הציפוי מכסה את בסיס הצלחת באופן אחיד. שאבו החוצה את התמיסה שנותרה והשתמשו בה לציפוי צלחת שנייה של מאה מילימטר. חזרו על הפעולה עבור מספר הצלחות הדרוש.

מספר הצלחות הדרוש משתנה בהתאם למספר רגמי הרקמה. ודאו שתמיסת הציפוי מכסה את בסיס הצלחות באופן אחיד, כפי שמוצג.

כסו את הצלחות במכסיהן. הניחו לצלחות להתייבש באינקובטור למשך שעה עד שעתיים ושאבו את התמיסה העודפת לפני השימוש להנחת רקמה ברונכיאלית. ניתן להניח צלחות תרבית מצופות שלא נעשה בהן שימוש בתוך שקית סטרילית ולאחסנן בטמפרטורה של 4 °C לשימוש מאוחר יותר.

השתמש במספריים קטנים וחדים, בסקלפל ובפינצטה שעברו חיטוי בתרסיס של 70% ethanol, והכנס אל תוך ה-BSC פלטות בעלות ציפוי שריטות על ידי לחיצה חזקה עם הסקלפל ליצירת סימני X קטנים ועמוקים, לפחות ארבעה לכל פלטה. אם השריטה אינה עמוקה מספיק, פיסות הרקמה לא יתמקמו במזרקים ויצופו בחוץ. מחוץ ל-BSC, הנח את הרקמה בצלחת P3. שטוף היטב את רקמת הסימפונות האנושית המבודדת ב-Bss.

פתחו את מקטעי הסימפונות. העבירו את הרקמה לתוך ה-BS והעבירו אותה לפלטת תרבית רקמה סטרילית של 100 מילימטר המכילה DM EM ham F 12 קר עם 1% antibiotic anti mycotic.

הניחו בעזרת פינצטה פיסה אחת של רקמה חתוכה במרכז כל X ולחצו. אפשרו לפיסות הרקמה או לשתולי ה-X להיצמד לצלחת למשך מספר שניות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 10 mils של מצע גידול מלא. אם הרקמה צפה לאחר הוספת המצע, השתמשו בפינצטה כדי לדחוף את הרקמה אל תוך חריצי ה-X או צרו X חדש. ייתכן שיהיה צורך ליצור Xs חדשים אם החריצים אינם עמוקים מספיק.

הניחו את הפלטות באינקובטור והחליפו את המצע בכל שלושה עד ארבעה ימים עד שהרקמות מוכנות להשתלה. כאשר צמחו תאי אפיתל מספיקים מסביב לרקמות כדי לכסות שטחים של 1 עד 2 סנטימטר, תהליך זה אורך כארבעה שבועות. השתמשו בפלטות מצופות ונשורות בקוטר מאה מילימטר.

מכיוון שחלק מהאקספלאנטים של הרקמה עשויים שלא להצליח, מספר הצלחות תלוי במספר נתחי הרקמה שאתם משבחים. אם אתם משתמשים בצלחות שעברו ציפוי מוקדם ואוחסנו בטמפרטורה של 4°C, יש להביא אותן לטמפרטורת החדר לפני השימוש. בעזרת פינצטה, הרימו בזהירות רקמה מהצלחת המקורית, הניחו אותה במרכז הציר בצלחת החדשה ולחצו בעדינות. יש להשליך רקמות שאינן מראות צמיחה.

אפשרו לרקמה להיצמד לפלטה. לאחר מספר שניות, הוסיפו מצע גידול והדגרירו. הוסיפו כפי שתואר קודם לכן עבור X explan.

הוסיפו 2 mL של תמיסת סטוק של trypsin ו-EDTA לכל צלחת תרבית רקמה של 100 mm. דללו את הסטוק עם 6 mL של PBS סטרילי 0.01 M; שתי mL של תמיסת סטוק ל-6 mL של PBS יניבו ריכוז סופי של trypsin של 250 µg/mL ושל EDTA של 100 µg/mL. לאחר העברת האקספלאנטים לצלחת חדשה, שאבו את המצע מהצלחות בעלות טבעות תאים של 1 עד 2 סנטימטר.

הוסיפו שמונה מיליליטרים של טיפות מהוללות חמות ומספר תמיסת edt לכל צלחת בת 100 מילימטר. והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 עד 15 דקות. בדקו בתדירות גבוהה.

השארת הטריפסין למשך זמן רב מדי תגרום לנזק לתאים. יש לבדוק את הפלטות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שמרבית התאים הופרדו; התאים יהפכו עגולים ויתנתקו כפי שמוצג ב-8-מיל של חימום. יש להוסיף 10% FBS למדיום בכל פלטה כדי לנטרל את תמיסת ה-EDTA.

ש combining את הנפחים מכל הפלטות למבחנה אחת או למבחנות נפרדות עבור רקמות שונות. ספרו את התאים באמצעות Hema Cytometer. סבובו במ centri-fuge ב-100 G למשך חמש דקות. משקע תאים ייווצר בבסיס המבחנה; השעו מחדש את משקע התאים במצע מלא עד לריכוז התאים הרצוי.

העבירו שני עד 3 מיליון תאים לכל בקבוק T 75 והוסיפו מצע גידול מלא לפי הצורך. דגרו והחליפו את המצע. בכל שלושה עד ארבעה שבועות, התאים מגיעים לצפיפות תת-מלאה (sub confluence) בבקבוקי D 75.

במשך כארבעה שבועות, יש להסיר את התאים ולהרחיבם, או להשתמש בהם לפני שהגיעו למצב של התמלאות מלאה (confluence) כדי למנוע הזקנה תאית. התחילו בהכנת הממברנות המאפשרות מעבר של ה-transwells. השתמשו באינסרטים בקוטר 6.5 מילימטר המתאימים לפלטות עם 24 בארות.

הוסיפו מצע לשני צדי הממברנה. 0.6 mils בחלק התחתון ו-0.1 mils בחלק העליון. הדגירו למשך שעה אחת באינקובטור לתרביות תאים.

הסיר בזהירות את המצע משני צדי הממברנה. התחל תחילה בנפח הבסיס; יש לנהוג בזהירות מכיוון שהממברנה עלולה להינזק בקלות. לכן, העבר את המצע באמצעות פיפטה לאורך דופן המבנית לתרבית (culture insert), והשתמש בנפח המומלץ.

אי-ביצוע פעולה זו יגרום לדליפת מדיום לבארים אחרות המשמשות לזריעת תאים. לאחר דגירה מוקדמת של התמיכה המאווררת, העבר בזהירות בעזרת פיפט את תרחיף התאים לצד האפיקלי של הממברנה עבור בארות של 6.5 millimeter, בנפח של 0.1 mils של תרחיף תאים לצד האפיקלי של הממברנה. העבר בפיפט 0.6 M מדיום לצד הבזאלי של הממברנה.

הזינו את התאים מהצדדים האפיקליים והבזאליים למשך 10 ימים. כדי להקים תרבית מובחנת היטב, החליפו את המצע פעמיים בשבוע. השתמשו בשיטה שהודגמה כדי להסיר את הנפח הבזאלי.

ראשית, החליפו את נפח המצע העליון והוסיפו 0.6 mL של מצע לצד הבסיס של הממברנה. שיטה זו מקדמת היצמדות של תאים לממברנה ומונעת חשיפה של התאים לאוויר למשך פרקי זמן ממושכים. החליפו את המצע במהירות והחזירו את הדגימה לאינקובטור.

צרו ממשק אויר-נוזל (air liquid interface) ביום ה-10 על ידי הסרת מצע ה-AAL והחלפת ה-0.6 ml של המצע בצד הבסיסי של הממברנה. תחזקו את התאים בממשק אויר-נוזל למשך שישה שבועות והחליפו את המצע פעמיים בשבוע. תאים ריסניים יחלו להופיע ארבעה שבועות לאחר יצירת הממשק.

ממשק נוזלי. התאים יגיעו לדיפרנציאציה אחידה לתאים מוששריים. שישה שבועות לאחר יצירת הממשק הנוזלי של האוזן.

מקטעים ברונכיאליים אנושיים עם תאים אפיתליאליים בריאים מתוך רקמות שהוסרו (explan) והשתלות. במחקר שלנו, תרביות מוצליחות מרקמות ברונכיאליות שהוסרו התקבלו בשמונה מתוך תשעה רקמות. כיוון שאחת התרביות מהרקמות שהוסרו נגועה בזיהום, טבעות התאים האפיתליאליים הגיעו לרדיוס של סנטימטר אחד עד שניים בתוך שלושה עד ארבעה שבועות.

נתחים מוצלחים של X תורבדו שוב עד שש פעמים. כל התרביות המוצלחות הראו עדויות לנדידת תאים בתוך 48 שעות מתחילת ההשתלות, או שנתחי X כפי שמוצג בתאי B הראו מראה של ריצוף (cobblestone), המאפיין תאים אפיתליאליים אלו כפי שמוצג ב-B. ובאיורים הבאים, צביעה אימונוהיסטוכימית של תכשירים של ציטוזין מתאים מהנתח ומתאים שנזרעו על לביבות זכוכית גילתה כי כל התאים היו חיוביים לציטוקרטין הספציפי לאפיתל; תאי סיבכיים אנושיים מתרבית משנית שגודלו עד למצב של סוב-קונפלואנס בבקבוקי T 75 מוצגים כאן. שימו לב למראה הריצוף.

תאי ברונכיאליים אנושיים בתרביות משנה הראו צביעה אימונוהיסטוכימית חיובית אחידה לקרטין ו-E.Can. צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים ספציפיים לסוגי תאים אחרים לא הראתה כל אינדיקציה לזיהום של התרביות על ידי פיברובלסטים, תאים מזנכימליים או תאים אנדותליאליים. לפרטים נוספים, אנא עיינו באיור חמישה ובמקרא שלו בטקסט. תאים שגודלו על ממברנות פוליאסטר חדירות או transwells עם ממשק נוזל התמיינו לאפית מוצנפת, כפי שמוצג כאן; יש להשליך את התאים ואת השתלים שלהם אם מופיעים תאים בעלי מורפולוגיה שונה מזו המוצגת כאן. בפרוטוקול זה, הצגנו שיטות מפורטות לתרבית ולהרחבה של תאי אפיתליום ברונכיאליים אנושיים ראשוניים.

מחקרים מבוססי תאים אנושיים נחוצים לקביעת מסלולים חשובים של מנגנוני מחלות ריאה בבני אדם ולסריקת רעילות וסריקה פרמקולוגית של תרופות חדשניות. אנו מקווים שהשיטות המתוארות כאן יעודדו אתכם לגדל תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מתוך נגעי רקמה (explants) ולהשתמש בתאים אלו במערכות המחקר שלכם. תודה ובהצלחה.