ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

מערכת זיהוי מיני דגים היא שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת המבוססת על DNA לזיהוי מיני הדגים הנמצאים בדגימה נתונה. דגימות דגים מטופלות ב-proteinase K כדי לשחרר חומצות גרעיניות לתמיסה. לאחר מכן, ה-DNA הגנומי של הדגים מבודל ומוגבר באמצעות PCR בעזרת פריימרים הנקשרים לרצפים הנמצאים בכל הגנומים של דגים.

לאחר מכן, מוביאים את תוצרי ה-PCR לעיכול באמצעות שלושה אנזימי הגבלה שונים ומפרידים אותם ב-Agilent 2100 bioanalyzer. ניתן להשתמש באורכי הפרגמנטים שנוצרו בתגובות העיכול כדי לקבוע את מין הדג באמצעות פולימורפיזם באורך פרגמנטים של הגבלה, או באמצעות תוכנה להתאמת תבניות RFLP. שלום, אני רחל פורמוזה מ-Agilent Technologies.

היום נדגים לכם פרוצדורה לזיהוי מיני דגים המבוססת על DNA. פרוצדורה זו היא שיטת סריקה המאפשרת לזהות את מיני הדגים הנוכחים בדגימות טריות, קפואות, טחונות, מבושלות, מיובשות או דגימות שעברו עיבוד אחר. ניתן להשלים תהליך זה בפחות מיום עבודה אחד.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לבחון את האותנטיות של פירות הים, נושא החשוב מאוד לתעשיית פירות הים כיוון שהחלפה וסימון שגוי עלולים להוביל להשלכות כלכליות, סביבתיות ולהשלכות על בטיחות מזון משמעותיות. בנוסף, קביעת מין הדג על ידי זיהוי חזותי ושיטות מסורתיות אחרות עלולה להיות קשה במיוחד. לאחר שהדג עבר עיבוד, בדיקת DNA מספקת תוצאה מדויקת ואמינה הרבה יותר.

כעת נתחיל. התחילו בהכנת הדגימות להפקת DNA על ידי העברה של 10 עד 1000 מיליגרם מכל דגימת רקמת דג, גולמית או מבושלת, למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עבור כל דג. הוסיפו לדגימה 220 מיקרוליטר של תמיסת proteinase K שהוכנה טרי, ובצעו שאיבה ושחרור חוזרת (pipette up and down).

דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה למשך שלוש עד חמש דקות ב-14,000 Gs כדי לשקיע רקמות שלא עוכלו. לאחר מכן, העבירו בזהירות 150 µL מכל אחד מהנוזלים העליונים (supernatants) למבחנה נקייה של 1.5 mL, תוך הימנעות מחומרים שלא עוכלו בתחתית ומחומרים שומניים הנמצאים בחלק העליון. הנוזל העליון ישמש כעת להפקת genomic DNA.

התחל את מיצוי ה-genomic DNA על ידי הוספת 500 microliters של בופר לקשירת חומצות גרעין לכל דגימה. פעולה זו תביא את הנפח הכולל של הדגימה ל-650 microliters. ערבב את הדגימה ב-Vortex עד להומוגניזציה.

בשלב הבא, העבירו כל דגימה לכוס ספין לקשירת DNA שהוצבה בתוך אחת ממבחנות הקליטה בנפח שני מיליליטר המסופקות בערכה. סגרו את מכסה המבחנה על חלקו העליון של כוס הספין. סובבו את הדגימות במשך דקה אחת ב-14,000 Gs כדי להטעין את ה-DNA על המטריצה של כוס הספין.

לאחר הסנטריפוגה, הוציאו את כוסות הסינון, השליכו את התסנין והחזירו את הכוסות למסורבות המכילות. הוסיפו 500 µL של בופר שטיפה בריכוז 1x עם מלח גבוה. סגרו את המסורבות במכסה והעבירו שוב לסנטריפוגה לאחר הסנטריפוגה.

שפוך את התסנן והחזר שוב את כוסות הצנטריפוגה (spin cups) לתוך מבחנות הקיבול. כעת הוסף 500 µL של 80% ethanol. סגור את המבחנה במיכל (cap) וסובב במהירות של 14,000 Gs למשך דקה אחת.

חזור על שטיפת האתנול פעמיים נוספות לאחר השטיפה השלישית ב-80% ethanol, והשליך את התסננים. החזר את כוסות הצנטריפוגה למבחנות התמיכה והפעל צנטריפוגה במשך שתי דקות כדי לייבש את מטריצת הסיבים. כעת העבר את כוסות הצנטריפוגה למבחנות איסוף של 1.5 milliliter.

הוסיפו 100 µL של תמיסת אלוציה (evolution buffer) לכל כוס ספין (spin cup), ישירות על מטריצת הסיבים בתוך הכוס. לאחר מכן, סגרו את מכסי מבחנות האיסוף על כוסות הספין והדגירו אותן בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר הדגירה, סובבו (spin) את הדגימות במהירות מקסימלית למשך דקה אחת.

בשלב הבא, השליכו את כוס הצנטריפוגה וסגרו את המבחנות במכסים. במידה ומודדים את ריכוזי ה-DNA, הצפייה היא לריכוזים הנעים בין 5 ng/µL ל-500 ng/µL. ניתן כעת לאחסן את ה-DNA בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד; לאחסון לטווח ארוך, מקמו את ה-DNA בטמפרטורה של 20- °C או 80- °C.

בצעו PCR באמצעות הפריימרים והריאגנטים המסופקים בערכת הריאגנטים P-C-R-R-F-L-P. בהתאם לפרוטוקול הכתוב המצורף, מומלץ להריץ כל דגימה, כולל בקרת חיובית ובקרת חסר-תבנית (no template control), בשכפול בזמן ריצת ה-PCR. הכינו תערובות מאסטר (master mixes) של אנזימי הגבלה עבור העיקרים עם DTE E one HAE three, ו-NL three על ידי ערבוב הרכיבים הבאים לפי הסדר: 1.5 µL של מים מזוקקים סטריליים, 0.5 µL של באפר אנזימטי 10x ו-0.5 µL של אנזים 10x.

הכינו כמות מספיקה לכל הדגימות בתוספת נפח של תגובה אחת מתערובת reagent fourex three. לאחר מכן, חלקו 2.5 µL לכל מבחנה תגובה המסומנת בשם הדגימה והאנזים. עם השלמת ה-PCR, הוציאו את הדגימות מהמעגל התרמי והניחו אותן על קרח.

הוסיפו 2.5 µL מכל תוצר PCR לכל אחד משלושת מבחני עיכול הרסטריקציה עבור אותה תגובה: DDE אחת, HAE שלוש, ו-NLA שלוש. לאחר מכן, ערבבו במכשיר וורטקס.

בצעו צנטריפוגה קצרה והדגירו את העיכולים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. במידה וזה נוח יותר, ניתן להדגיר את העיכולים למשך הלילה. לאחר העיכול, הדגירו את התגובות בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של EDTA בריכוז 60 millimolar לכל מבחנה כדי לעצור את התגובה וערבבו במערבל (vortex). באמצעות ערכת התסריעים של ה-Agilent bioanalyzer, הכינו והטעינו את תוצרי עיקר ה-restriction digest לבארות של שבב DNA בהתאם למדריך הערכה. עבור כל דגימה, יש להטעין את שלושת העיקרים על אותו שבב.

לאחר מכן, ערבבו את השבב במערבל (vortex) והכניסו אותו למכשיר. עם סיום ההרצה, עברו להקשר הבדיקה (assay context) ובחרו בלשונית סיכום השבב (chip summary). בשדה שם הדגימה, הזינו שם דגימה עבור כל 12 הבארים של השבב כדי לזהות את מיני הדגים עבור דגימות ה-DNA לבדיקה.

הפעילו את תוכנית פענוח ה-RFLP על ידי לחיצה על הקובץ. לאחר מכן פתחו את קובץ ה-XAD. תיפתח תיבת דיאלוג לפתיחת קבצים.

כעת בחרו את קובץ ה-XAD עבור שבב ה-DNA שבו השתמשתם. לחצו על "Open" (פתח) כדי לראות רשימה של הדגימות שהוטענו על השבב. בחרו את שלושת העיקרים (digests) המתאימים לדגימת ה-DNA הראשונה.

בעמודת האנזים, ציינו את אנזימי ההגבלה ששימשו בשדה המסומן כגובה שיא מינימם כאחוז מהסמן התחתון. ערך ברירת המחדל הוא 10% במידת הצורך. ניתן להוריד ערך זה כדי לזהות שיאים קטנים שהוחמצו, או להעלותו כדי להשמיט שיאים הנובעים מרעש לא ספציפי באלקטרופורגרמה.

לאחר ביצוע התאמות לערך גובה השיא המינימלי (min peak height), לחצו על reintegrate. כעת לחצו על calc בתחתית תיבת הדו-שיח. נתוני אורך הפרגמנט שהתקבלו מהרצת ה-bioanalyzer ימלאו את השדות בתוכנה.

בשלב הבא, ברשימת התיבה הנפתחת של הניקוד (score) בפינה השמאלית העליונה של המסך, בחרו ב-dice. אם דגימת הדגים מורכבת ממין דגים בודד או מתערובת, ובמיוחד אם הדגימה עשויה להיות תערובת, עיינו בטבלה בתחתית המסך המסומנת כ-combined score list. שם יופיעו התאמות המינים הטובות ביותר בהתבסס על תוצאות כל שלוש תגובות העיכול.

התאמות מושלמות עם ציון של אחת מודגשות בירוק. התאמות קרובות מודגשות בצהוב בחלקו העליון של המסך. ערך סף ה-cutoff הנמוך מציין את גודל הפרגמנט המינימלי ששימש בניתוח, וערך סובלנות ההתאמה קובע עד כמה אורך הפרגמנט חייב להיות קרוב לאורך הפרגמנט החזוי כדי להיחשב כהתאמה.

הערכים המוצגים הם הגדרות ברירת המחדל וניתן להתאימם. חזור על שלבים אלה עבור ניתוח שאר דגימות ה-DNA שעל הקצה. דגימות DNA מארבעה מיני דגים שונים בודדו, הועשרו ועוברו בעיכול באמצעות השיטה המתוארת בסרטון זה.

כאן מוצג ג'ל של ביו-אנליזר המראה את דגימות עיכור הרסטריקציה, תוך שימוש ב-Agilent Bioanalyzer ובמפענח RFLP. דפוסי כיפוף של התוכנה משמשים כאן לזיהוי הדגים. הדגימה הראשונה מזוהה נכון כפורל, השנייה כטונה, והשלישית כדג סלע.

והדגימה האחרונה כקוד ספציפי. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע זיהוי מיני דגים המבוסס על DNA באמצעות שיטת ה-P-C-R-R-F-L-P של Agilent. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להימנע מזיהום צולב של דגימות, מכיוון שהשיטה רגישה מאוד.

זהו זה. כעת אתם יודעים כיצד לזהות במהירות, בקלות ובדיוק את מיני הדגים הנוכחים בדגימות שלכם. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.