Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק
30 באפריל 2010
Microdissection לייזר יושמה כדי לנתח את הביטוי פרופיל גנטי בתאים מסוימים של הדיסק כנף תסיסנית נתון RNAi מקומי In vivo. RNA המופק אזורים המקבילה של תאים הושתק unsilenced נותח על ידי RT-PCR כמותי כדי לקבוע פרופיל השוואתי ביטוי גנים בהקשר של microecology רקמות הילידים.
במסמך זה אנו מספקים תיאור מקיף של מיקרודיסקציה בלייזר, שיושמה לצורך השוואת פרופיל תעתוקי של RNA באזורים מושתקים ואזורים שאינם מושתקים בדיסק הכנף של droso phila. גישה זו דורשת כחומר ביולוגי דיסקים של כנף droso phila שבודדו ידנית, וכציוד מרכזי מיקרודיסקטור לייזר. אנו משתמשים במכשיר LI A-L-L-M-D 6, 000 ובמכשיר PCR בזמן אמת.
השתמשנו במכשיר BioRad iq. חמישה כלים קטנים הנדרשים הם פלטה קעורה, מברשת צבע קטנה, פינצטה למיקרו-דיסקציה, שקופית לטיפות תלויות, פינים לחרקים המורכבים על מחטי מזרק, מסגרת מתכת עם ממבנה דם (membrane) ופחלוני פלסטיק קטנים. שיטה זו כוללת את השלבים הבאים.
שלב ראשון: הכלאה בין שני קווי שוואו-טרנסגניים (oph transgenic) מתאימים, במטרה להוביל להשתקה גנטית מקומית וספציפית בצאצאים באמצעות מערכת ה-GAL four UAS. שלב שני: הכנת מסגרות הניתוח. שלב שלישי: הגדרת המיקרו-דיסקטור הלייזרי.
שלב ארבע, איסוף ידני של הדיסקים של התאים המייסדים (imaginal discs) של הכנף מהצאצאים הזחליים של ההכלאה הגנטית. שלב חמש, ביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר של אזורים ספציפיים בדיסקים המסומנים ב-GFP. שלב שש, פרופיל שעתוק של אזורים מקבילים בדיסקים שבהם הגן הושתק ובאזורים שאינם מושתקים יאפשר לבסס את ההשפעות שנגרמו כתוצאה מהשתקת הגן המדובר.
ניתוח פרופילי תעתוק in vivo של הגן, שניתן לכנותו גן X, ידרוש הפקת RNA מהאזורים שעברו מיקרו-דיסקציה, בקרת דיוק של הדיסקציה הידנית, הערכת ביטוי GFP בשני הדגימות באמצעות R-T-P-C-R, כימות הביטוי של מטרות פוטנציאליות של הגן המושתק בשתי הדגימות באמצעות Real-time R-T-P-C-R או על ידי ביצוע אנליזת מיקרו-מערך (microarray). להלן פירוט רב יותר על כל שלב.
השלב הראשון, ההכלאה הגנטית. ההכלאה הגנטית כוללת זני GAL4 UAS טרנסגניים ומתמקדת בהשגת דיסקים דמיוניים (imaginal discs) מושתיקים בצאצאים בשלב הזחל. מערכת ה-GAL4 הרב-גונית מאפשרת להפעיל השתקה ספציפית וממוקמת של גנים באמצעות הפרעה ב-RNA.
זן אחד מביא להכלאה את טרנסגן הדרייבר (driver transgene), המבטא GAL4 בתבנית זמנית או מרחבית ספציפית, וכן רפורטר UAS-GFP המאפשר ויזואליזציה של תחום הביטוי של GAL4. הזן השני מביא טרנסגן רספונדר (responder transgene) מסוג UAS המבטא RNA משתיקה בצורת סיכת ראש (hairpin silencing RNA), המסוגל להתמקד ספציפית בגן X מרגע ביטויו בתא.
RNA זה נחתך כדי ליצור RNA מפריע קטן (siRNA), המסוגל להשתיק באופן ספציפי את הגן X הנבחר בצאצאים של הכלאה זו. התראנסגן להשתקה מבוססת UAS מותעת רק באותם תאים המבטאים את חלבון GAL4, ובכך הוא משרה השתקה מוגבלת מרחבית של הגן X. מבין מגוון היישומים, התמקדנו בפרופילי תעתוק של RNA בדיסק כנף שהושתק על ידי דרייבר Grailed GAL4, המכוון השתקה ספציפית במדחור האחורי.
אזור השתיקה מסומן על ידי ביטוי של הטרנסגן U-A-S-G-F-P. במדור האחורי. שני אירועים יעוררו את ביטויו של GGFP ואת השתיקה של גן x.
שלב שני, טיפול במסגרות הדיסקציה (ניתוח) כדי לעכב את פעילות ה-RNases. שטפו את שקופיות המסגרת ואת כלי הדיסקציה במים עם DEPC למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר, והניחו להם להתייבש בתא סטרילי. כדי לעכב את פעילות ה-RNases, השתמשו במבחנה חדשה בנפח 50 ml שהיא כבר נקייה מ-RNases, מלאו אותה במים עם DEPC והכניסו למבחנה פינצטה, שקופית טיפה תלויה ומסגרת PET.
שני הפריטים נחוצים עבור המיקרו-דיסקציה. סגרו את המבחנה, הפכו אותה על פיה, ולאחר מכן השאירו אותה להגיב למשך שעה אחת לפחות. בטמפרטורת החדר, לאחר שעה, העבירו את ה-DEPC water למבחנה אחרת באמצעות הפינצטה.
החזיקו את השקפים בתוך המבחנה כדי שלא ייפלו. לאחר מכן, הניחו לשקפים להתייבש בתוך המבחנה. שלב שלוש, הגדרה למיקרו-דיסקציה.
ראשית, הדליקו את כל המכשירים הדרושים: את נורת הפלואורסצנציה, את המיקרוסקופ ואת התוכנה למיקרו-דיסקציה. חלון אזהרה יזכיר לכם להדליק גם את הלייזר. עשו זאת ואפשרו ללייזר להתחמם בזמן שתשלימו את הגדרות המיקרו-דיסקציה.
עתה הגיע הזמן להכין את הבארים שבהן ייאסף הרקמה הגזור. מכשיר הגזירה בלייזר Leica LMD 6,000 מאפשר טעינה של עד ארבעה מבחנות לאיסוף דגימות שונות. למטרתנו, נזדקק לשתי מבחנות בלבד.
אחד, לאיסוף רקמה מושתקת חיובית ל-GFP, והשני לאיסוף רקמה לא מושתקת שלילית ל-GFP באמצעות מיקרו-מלקחים. מלא את שני מכנסי המבחנות ב-20 µL של תמיסת TRI reagent כדי לשמר את ה-RNA. כעת המיקרו-דיסקציה מוכנה לשימוש. שלב ארבע, דיסקציה ידנית של דיסקי תמונת כנף מזחלי דרוזופילה.
בודד את דיסקי הכנף (wing discs) מצאצאי הזחלים שהתקבלו כפי שתיאור קודם, והקפד שרקמות אחרות לא יזהמו את הדיסקים. כדי להשיג מטרה זו, שיטת הדיסקציה שונה למדי מזו המשמשת בדרך כלל לאיסוף המסה של כל הדיסקים המקוריים. ראשית, שטוף את הזחל בתמיסת רינגר (ringer's solution) כדי להסיר שאריות מדיה דבקים. לאחר מכן, העבר אותו לשקופית טיפה תלויה (hanging drop slide) וחתך את הראש תוך써 משיכה מיידית של הפה כלפי מטה.
השתמשו בסיכות החרקים כדי להסיר בזהירות רקמות אחרות. המסגרת האדומה מראה את הדיסקים של כנפי הדמיונות (imaginal wing discs) שיש לאסוף. שמרו על הדיסקים נקיים מרקמות דבקות והעבירו במהירות ובעדינות כל דיסק כנף מבודד למסגרת ניתוח לצורך חיתוך מיידי.
יש לחזור על פרוצדורה זו עד להגעה למספר כולל של מאה דיסקים של כנף. שלב חמישה, מיקרו-דיסקציה בלייזר של אזורים ספציפיים בדיסקים של כנף המסומנים ב-GFP. ברגע שהדיסק המקורי של הכנף נמצא על הממברנה, ניתן להמשיך בחיתוך.
הניחו את המסגרת על התושבת שלה וקבעו את התושבת על הבמה הממוטרת. אתרו את דיסקת הכנף המקורית באמצעות ה-LMD 6,000 המשמש כמיקרוסקופ רגיל. התמקדו בה והגדירו את החיתוך.
שרטטו שטח אובלי שיכיל את שני צדי הדיסק, את החלק החיובי ל-GFP ואת החלק השני. בחרו את מכסה המבחנה שבה תרצו לאסוף את החלק החיובי ל-GFP. לחצו על כפתור Start cut.
המיקרו-דיסקטור (micro dissector) ממשיך בחיתוך הרקמה במהירות ובבעוצמה שהוגדרו מראש באמצעות בחירת פונקציות ההזזה והחיתוך. ניתן לדייק את החיתוך ידנית עד שנפלה חתיכת הרקמה שלא נבחרה. האנימציה התלת-ממדית מראה את התהליך המתרחש תחת חיתוך המיקרו-דיסקטור, כאשר קרן לייזר ממוקדת על הרקמה ומבצעת חיתוך לאורך ההיקף שנבחר.
לאחר ביצוע החיתוך, פיסת הרקמה נופלת אל תוך מכסה המבחנה הנבחרת ובעקבות זאת אל תוך ה-tri Reagent. לאחר החיתוך הראשון, העבירו את אזור החיתוך לצד השני של דיסקיות הכנף (wing disc) כדי לחתוך אזור מקביל שלילי ל-GFP. לפני ביצוע החיתוך החדש, הקפידו לבחור מכסה מבחנה שונה כדי להפריד בין הרקמות החיוביות ל-GFP לרקמות השליליות ל-GFP.
לחץ על כפתור תחילת החיתוך (start cut) לאחר החיתוך האוטומטי. המשך לעדן את החיתוך באופן ידני כפי שמוצג באנימציית התלת-ממד לפני החיתוך השני. השולחן הממוטרי מזיז את מכסה המבחנה הנבחר אל אזור החיתוך.
קרן הלייזר מתמקדת ברקמה לאורך ההיקף שנבחר, ולאחר השלמת החיתוך, חתיכת הרקמה נופלת אל תוך מכסה המבחנה הנבחרה המכילה Tri reagent. כדי לאסוף מספיק חומר, חזרנו על הפרוצדורה במאה דיסקים של כנפי בוגר (imaginal wing discs). לאחר איסוף הדגימות, הוצא את המבחנות.
זהו שלב עדין שעלול להוביל לאובדן כל העבודה שביצעת עד כה, לכן יש לנהוג בזהירות. סגור את המכסה כשהוא הפוך והמשך בניסוי.
זהו הרקמה החיובית ל-GFP. זוהי הרקמה השנייה, החיובית ל-GFP. שלב שש, פרופיל תעתוק.
סובב את המבחנות כדי להפריד את הנוזל מהמכסה והוסף עד מיליליטר אחד של ריאגנט Try. בצע מיצוי RNA בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של ריאגנט try ממאה אזורים בשטח של כ-5,000 µm² כל אחד. התנובה שהשגנו הייתה 1.5 µg של RNA.
השתמשנו ב-superscript three ב-vitrogen כדי לסנתז CD NA עם hexa אקראי. דיוק הדיסקציה הידנית נבדק על ידי בדיקת ביטוי GFP בשני הדגימות באמצעות R-T-P-C-R. כפי שמוצג בג'ל עם R-T-P-C-R כמותי.
הערכנו את רמות הביטוי של הגן המודחק X יחד עם רמות הביטוי של מטרות פוטנציאליות אפשריות של מסלול הוויסות המתווך על ידי הגן X. דיאגרמה זו מציגה דוגמה לרמות הביטוי של הגן X ואחד ממטרותיו הפוטנציאליות. נקרא להן גנים Y ביחס לרמות הביטוי הבסיסיות שלהם במדורים הקדמיים והאחוריים של דיסקיות כנף שאינן מוצקות.
נמצא כי הפעילות של הגן הנבחר X פחתה ל-40% לאחר השתקה. לעומת זאת, אחד מיעדיו המשוערים, הגן Y, נמצא במצב של ביטוי מוגבר (upregulated) באופן משמעותי, עם עלייה פי שבעה, מה שהוביל אותנו לתקף את ההשערה כי הוא מווסת באופן שלילי על ידי הגן X. אנו מסיקים כי הגישה הניסוית המתוארת לעיל יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאימות של יעדים משוערים במסלולי בקרה מגוונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את היישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser microdissection) לניתוח של פרופילי ביטוי גנים במדורים ספציפיים של דיסק הכנף של ה-Drosophila. באמצעות השוואה בין אזורים מושתקים לאזורים שאינם מושתקים, המחקר מספק תובנות לגבי ביטוי גנים בהקשר של המיקרו-אקולוגיה של הרקמה המקורית.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדע
- מדעי העצבים
- ביטוי גנים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרת ניתוח מדויק של אזורי רקמה ספציפיים.
- דיסקיות כנף של Drosophila משמשות כמודל לחקר ביטוי גנים.
- השתקת RNA (RNAi) משמשת להשתקת ביטוי גנים במדורים ממוקדים.
- Quantitative RT-PCR משמש להערכת רמות ביטוי גנים.
מטרת המחקר
- לבדיקת ההשפעות של RNAi מקומי על ביטוי גנים בדיסקים של כנפי Drosophila.
- להשוואת פרופילי ביטוי גנים בין מדורים מושתקים למדורים שאינם מושתקים.
- להעמקת ההבנה של המיקרו-אקולוגיה של הרקמה בתהליכי התפתחות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרו-דיסקציה בלייזר של דיסקים של כנפי Drosophila.
- מיצוי RNA מדגימות רקמה שבוצע להן דיסקציה.
- RT-PCR כמותי לניתוח ביטוי גנים.
- השוואה של פרופילי ביטוי גנים בין מדורים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי ביטוי גנים דיפרנציאלי באזורים מושתקים לעומת אזורים שאינם מושתקים.
- תובנות לגבי תפקידם של גנים ספציפיים בהתפתחות דיסק הכנף.
- הדגמה של יעילותה של מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser microdissection) בפרופיל גנים.
- תרומה להבנת הבקרה הגנטית הספציפית לרקמה.
מסקנות
- מיקרו-דיסקציה בלייזר היא כלי בעל ערך לחקר ביטוי גנים באזורי רקמה ספציפיים.
- RNAi מקומי יכול לשנות ביעילות פרופילי ביטוי גנים ב-Drosophila.
- הממצאים מרחיבים את הידע על ויסות גנים בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המבצע
מיקרודיסקציה בלייזר בשילוב השתקת גנים ספציפית למדור מאפשרת פרופיל תעתוקי מדויק של אוכלוסיות תאים מוגדרות בתוך רקמות הטרוגניות. גישה זו נותנת מענה לאתגר ההטרוגניות התאית במחקרי ביטוי גנים בשלבי הגילוי, ותומכת בהורדת סיכונים מכניסטית ובתיקוף מטרות במערכות ביולוגיות מורכבות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי עבור החלטות פורטפוליו בשלבים מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה מדויקת של תגובות תעתוק בסביבות רקמה טבעיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של תפקודי גנים ומסלולים רגולטוריים באוכלוסיות תאים המוגדרות מרחבית.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד השפעות שעתוק של השתקת גנים בתוך מדורים טבעיים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מדידה ישירה של שינויים בביטוי גנים במורד המסלול.
- משפר את רמת הביטחון החזויית עבור קידום מטרות בעלות פעילות התלויה בהקשר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות ביולוגיות מאושרות, ספציפיות למדור, לצורך ניתוח טרנסקריפטומי המשכי.
- מנקב את איסוף הדגימות והפקת RNA מאזורי רקמה מוגדרים, ובכך משפר את השחזוריות.
- מאפשר קריאות RT-PCR כמותיות ומיקרו-מערכים (microarray) לצורך פיתוח מערכים רבסטים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות השתקת גנים (gene knockdown) בתהליכי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פרופיל ביטוי הגנים למבנה הרקמה הרלוונטי למחלה במערכות מודל.
- מספקת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח טרנסקריפטומי מקומי.
- מפחיתה סיכונים בהתקדמות תרגומית (translational) על ידי אישור מעורבות המטרה במדורים רלוונטיים פיזיולוגית.
- תומכת בזיהוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) בתוך שושלות תאים ספציפיות כאשר הדבר מוצדק על ידי מערכת המודל.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת מחקרים של תפקודי גנים המונחים על ידי היפותזות במדורי רקמה מוגדרים, ובכך תומכת בזיהוי מועמדים (leads) ובתיקוף מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים על ידי בידוד תגובות שעתוק למעיקון גנים.
- סריקה: מספקת פלטי ביטוי גנים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתוני RT-PCR ומערכי מיקרו (microarray) ספציפיים לתאים עבור ניתוח השוואתי של אזורים מושתקים לעומת אזורי בקרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי שמירה על ההקשר הרקמתי הטבעי במחקרי ביטוי גנים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר עבור פרופיל טרנסקריפטומי על פני הפרעות גנטיות וסוגי רקמות מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות ושיפור השחזוריות של אנליזות טרנסקריפטומיות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרת תפקוד גנים התלוי בהקשר.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום מטרות עם פעילות מאושרת הספציפית למדור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במערכות מודלים גנטיים ובמכשור למיקרודיסקציה לייזר.
- דורש גישה לפלטפורמות מיקרודיסקציה מונחות פלואורסצנציה ותשתית ל-RT-PCR כמותי.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים לטיפול בדגימות ולפרוטוקולי מיצוי RNA.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי רקמות שונים או לאורגניזמי מודל, בהתאם למדוריות ולזמינות הסממנים.
- ניבוי הדגימה ושלמות ה-RNA הם מגבלות קריטיות שיש לנהל במהלך האיסוף והעיבוד.
