MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה
29 באפריל 2007
וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה / אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).
ברוכים הבאים למדריך של מעבדת CHI על שיטת השכבה הדקה במיוחד, אשר שימושית במיוחד לקביעה מדויקת של מסת חלבונים. בשל רגישותה של ספקטרומטריית מסות, אנו משתמשים אך ורק בריאגנטים בדרגת HPLC וכן בכפפות לטקס או ניטריל נטול אבקה לניקוי הפלטה. שטפו לסירוגין עם מתנול ומים, ובסיום שוב במתנול.
בין שטיפה אחת לשנייה, נגבו בעדינות את עודפי הממס באמצעות נייר עדשות. ניתן לחזור על שלבי השטיפה הללו כמספר הפעמים שיידרש כדי לקבל פלטה נקייה. לאחר שהפלטה נקייה ויבשה, יש להשתמש בה באופן מיידי.
יש למרוח ולהפיץ 20 עד 30 µL של תמיסת תשתית לשכבה דקה על גבי לוח MALDI נקי. כאן אנו משתמשים בקצה של פיפט P250 כדי להפיץ את התמיסה באופן שווה תוך הימנעות משריטת הלוח. בעת התייבשות השכבה הדקה, יש להסיר טיפות מים שנותרו, במידה וישנן, על ידי ספיגה עדינה עם נייר Kimwipe.
לאחר מכן, נגבו בעדינות את הפלטה בתנועה חלקה אחת באמצעות Kim wipe כדי ליצור את השכבה הדקה בצורה נכונה. לבסוף, נקו את שולי הפלטה כדי למנוע זיהום של מספק המסות (Mass spectrometer). חיוני לבצע בדיקה של השכבה הדקה לפני יישום הדגימה.
אם נקודת הבדיקה לוקחת זמן רב מדי להתייבש במקומות שבהם הגבישים אינם הומוגניים, ייתכן שהבעיה נעוצה בשכבה הדקה עצמה או בתמיסת המטריצה; יש לנקות את הפלטה, למרוח מחדש את השכבה הדקה ולבצע את הבדיקה שוב. בעת הנחת נקודות על השכבה הדקה, אין לאפשר לנקודות להתאדות עד ליובש מוחלט. במקום זאת, ברגע שהתגבשות הואתה ונעצרה, יש להסיר את עודפי הממס.
בעזרת שואב ואקום, נוכחותם של מזהמים כגון מלחים ודטרגנטים, כמו גם ריכוז גבוה של האנליט, עלולים להפריע להתגבשות. דילול נוסף של הדגימה עשוי לשפר את ההתגבשות. סמן את הנמלים בקרבה רבה לדגימה. פעולה זו תאפשר כיול פנימי פסאודו, שבו הפלטה מוזזת מנקודת הדגימה לנקודת הכיול.
במהלך רכישת הדגימה, הוספת מספר פולסים של לייזר של ה-CAS לספקטרום מבטיחה גישה זו כיול של דיוק מסה גבוה יותר מאשר כיול חיצוני בלבד. חשוב מאוד לשטוף מזהמים כגון מלח או דטרגנט שעלולים להפריע ליינון האנליט. לשם כך, טפטפו חומצה טריפלואורואצטית (TFA) בריכוז 0.1%, קרה מאוד, במים בדרגת HPLC ישירות על הנקודות.
הסר את תמיסת השטיפה באמצעות שואב ואקום (Aspirator) כפי שמוצג כאן. שיטה זו מניבה ספקטרה מצוינת הן עבור חלבונים ממברנתיים והן עבור חלבונים מסיסים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הכנתה של שכבת מטריצה/אנליט דקה במיוחד לצורך ניתוח פפטידים וחלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסות ביינונית של דסורפציית לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-MS). שיטה זו חיונית לקביעה מדויקת של מסת חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ספקטרומטריית מסות
- ניתוח חלבונים
- כימיה אנליטית
רקע
- ספקטרומטריית מסות היא טכניקה רגישה לניתוח ביו-מולקולות.
- הכנת פלטת הדגימות היא קריטית לקבלת תוצאות מדויקות.
- לניקוי מומלץ להשתמש בריאגנטים בדרגת HPLC.
- טכניקות טיפול וניקוי נאותים משפרות את איכות האנליזה.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטת השכבה הדקה במיוחד עבור MALDI-MS.
- להבטחת קביעה מדויקת של מסת חלבונים.
- לספק מדריך למעשה על שיטות העבודה המומלצות להכנת דגימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בריאגנטים בדרגת HPLC.
- ניקוי הפלטה באמצעות מתנול ומים.
- ניגוב שאריות ממס בעזרת נייר לעדשות.
- שימוש מיידי בפלטה המנוקה לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של שיטות ניקוי יעילות עבור פלטת הדגימה.
- הדגשת החשיבות של שימוש בחומרים מתאימים.
- הצגת שלבי ההכנה לשכבה דקה במיוחד.
- מתן תובנות לגבי שמירה על שלמות הדגימה.
מסקנות
- שיטת השכבה הדקה במיוחד חיונית למספקטרומטריית מסה מדויקת.
- טכניקות ניקוי והכנה נאותות הן חיוניות.
- הקפדה על שיטות עבודה מומלצות יכולה לשפר משמעותית את תוצאות האנליזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
קביעה מדויקת של מסת חלבונים היא קריטית לצורך תיקוף המטרה וזיהוי תרכובות מובילות (leads) בשלבים מוקדמים של הגילוי. שיטת הכנת הדגימות ל-MALDI בשכבה דקה במיוחד משפרת את איכות הנתונים על ידי הגברת העמידות לזיהומים ואחידות מרחבית, ובכך תומכת בהערכה מהימנה של התרכובות. שיטה זו מאפשרת ביטחון בחיזוי מאפייני החלבון, ומפחיתה עמימות מכניסטית בבחירת מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר קביעה מדויקת של מסת חלבונים, ובכך תומך בבחינת היפותזות טיפוליות ובתיקוף של מטרות פונקציונליות.
- ערך תפעולי: מספק עמידות גבוהה יותר למלחים ולדטרגנטים, ובכך מפחית את מספר התוצאות השליליות השגויות בדגימות הנוטות לזיהומים.
- ערך חיזויי: משפר את הרזולוציה ואת האחידות המרחבית, מה שמעלה את רמת הוודאות לגבי זהות החלבון ומצב המודיפיקציה שלו.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר ספקטרה איכותית הניתנת לשחזור, החיונית לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולעקביות בקריאה הכמותית.
- ערך תפעולי: משתמש בשלבים פשוטים וחסונים התואמים לסביבות של סריקה בתפוקה גבוהה.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): מאפשרת הכנה של פלטות דגימות מאומתות עבור תהליכי עבודה המשכיים, ותומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה לאורך פרויקטים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בניתוח של חלבונים ממברנתיים וחלבונים מסיסים, ומאפשר אפיון של מערכות רלוונטיות למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מקל על קביעה מדויקת של מסות של חלבונים בטווחים רחבים (עד 380 kDa), ובכך מסייע באופטימיזציה של תרכובות מובילות.
- הלימה למודלים פרה-קליניים: ישים על תעלות יונים, נשאים וקולטנים, ותומך בתיקוף מטרות במודלים רלוונטיים פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת השכבה הדקה במיוחד (ultra-thin layer) משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד לאפיון פרה-קליני, ומאפשרת ניתוח חלבונים מהימן בכל שלב.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אספקת נתוני מסה מדויקים לזיהוי ואפיון חלבונים.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור, המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות בפיתוח בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מייצרת ספקטרומים של מסה ברזולוציה גבוהה עם אחידות מרחבית, ובכך משפרת את השוואתיות של הנתונים בין תנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשרת בין שלב הגילוי לרצף הפרה-קליני באמצעות ניתוח עקבי של מסת חלבונים על פני סוגי דגימות שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת סטנדרטית וחסונה להכנת דגימות, הישmime לשימוש במגוון מחלקות חלבונים ופרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בקביעת מסת חלבון, הפחתת עמימות מכניסטית בתיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ועמידות למזהמים נפוצים כגון מלחים וחומרים דטרגנטיים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות go/no-go טובות יותר באמצעות שיפור איכות הנתונים, המפחיתה סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על נתוני אפיון חלבון מהימנים.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגימות לספקטרומטריית מסות ובעקרונות של MALDI-MS.
- נדרש גישה למגיבים בדרגת HPLC, לשואב ואקום ולפלטות תואמות MALDI.
- נדרשים נהלי ניקוי וייבוש סטנדרטיים כדי להבטיח אחידות של השכבה.
- נדרשת התאמה לריכוזי אנליטים ומטריצות דגימה משתנים.
- מוגבל על ידי הצורך בשימוש מיידי בפלטה לאחר הניקוי כדי למנוע זיהום חוזר.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
