וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

פרוטוקול זה מדגים שיטת ביו-אינפורמטיקה מבוססת וידאו למדידת צמיחת מושבות של תאי גזע עובריים אנושיים, באמצעות ניתוח סרטוני time-lapse שנאספו באינקובטור icon bio station CT המצויד במצלמה לדמיון וידאו. מושבות של תאי גזע עובריים אנושיים (HESC) תורגבשו עד למסף של 70% fluency, נזרעו מחדש והודגרו למשך 48 שעות, שלאחר מכן צולמו סרטוני הווידאו של מושבות ה-HESC למשך 48 שעות נוספות ב-Biot ct. קצב הצמיחה נקבע באמצעות שיטות של שיפור סגמנטציה ומדידה שפותחו עם תוכנת CL quant.

המתכונים תוקפו באמצעות השוואה ל-Adobe Photoshop, כלי לניתוח תמונות המאפשר התאמה ידנית מדויקת של מסכה לכל מושבה. ניתן להשתמש בתחום המתפתח של ביו-אינפורמטיקה של וידאו כדי לאוטומט את העיבוד, הניתוח והכרייה של נתונים ביולוגיים מסרטוני מיקרוסקופיה. שלום, אני סרנה לין מהמעבדה של ד"ר פרו טאלבוט במחלקה לביולוגיה של התא ומדעי העצבים כאן באוניברסיטת קליפורניה ריברסייד.

שלום, אני שון פינו, גם אני ממעבדת טלבוט. שלום, אני טי סאטיש מתוכנית הדוקטורט לביולוגיה תאית, מולקולרית והתפתחותית. היום נראה לכם כיצד למדוד צמיחה של מושבות תאי גזע עובריים אנושיים באמצעות כלי ביואינפורמטיקה של וידאו.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי למדוד את השפעותיהם של רעלים סביבתיים על התנהגותם של תאי גזע עובריים אנושיים. נדגים נוהל זה במתקן הליבה החדש שלנו לתאי גזע. אז בואו נתחיל.

כדי להכין HESC לניתוח וידאו, גדלו HESC על פלטות שש בארות מצופות ב-matrigel עד להגעה ל-70% confluent, שאבו את המצע מאחת הבארים המכילה HESC ושטפו פעמיים עם 1 mL של PBS. הוסיפו 1 mL של Accutane והדגירו למשך דקה אחת ב-37 °C ב-5% carbon dioxide. לאחר מכן, הוסיפו 10 עד 12 חרוזי זכוכית לבאר ונערה את הפלטה בעדינות עד להתנתקות מלאה של המושבות.

נטרלו את ה-Accutane באמצעות מיליליטר אחד של מצע תחזוקה לתאי גזע עובריים אנושיים או מצע מותנה של פיברובלסטים עובריים של עכבר. אספו את התאים שהסתרו ללא החרוזים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר וסובבו בצנטריפוגה ב-200 G למשך שלוש דקות. שפכו את ה-SUP natant ופרו את המשקע עם 500 מיקרוליטר של מצע תחזוקה טרי לתאי גזע עובריים אנושיים או M-T-E-S-R. טפטפו 100 מיקרוליטר של תגסוס ה-HESC לתוך בארות מרובות של פלטת 12 בארות מצופה ב-matrigel.

נענעו את הפלטה קדימה ואחורה בעדינות ובחנו את התרביות תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שצברי התאים מפוזרים באופן שווה בכל הבארות. הניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees וב-5% carbon dioxide למשך 48 שעות כדי להבטיח שהתאים נצמדו בצורה שטוחה ומספיק גדולים להדמיה קלה. לאחר 48 שעות, שאבו את המצע ושטפו את הבארות עם 500 microliters של PBS כדי להסיר תאים שאינם צמודים, ולאחר מכן הוסיפו 500 microliters של מצע M-T-E-S-R לכל בארה.

הניחו מיד את הצלחת בתוך ה-Biot CT והתחילו באיסוף תמונות בשיטת time-lapse. נסו לבחור שדות עם מושבות בודדות ומובחנות שאינן צפויות לגדול אל תוך מושבות אחרות. בפרוטוקול זה, התאים מוקלטים בווידאו למשך 48 שעות נוספות, עם פריימים במרווחים של שבע דקות.

כדי ליצור תחילה את מתכון הסגמנטציה, סרקו ידנית את הסרטון כולו כדי לוודא שהוא מכיל מושבה אחת שנותרה במצב פוקוס לאורך כל תקופת ההקלטה. לאחר מכן, פתחו את אשף הסגמנטציה בתוכנת CL quants ולחצו על כפתור ה-next. בחרו את ערוץ התמונה הנכון ולחצו על כפתור ה-next.

בחר באפשרות soft matching ולחץ על Next. בחר אזור אחד או שניים הרצויים על ידי סימון מעגל מהקצה החיצוני אל האזור המרכזי של המושבה. שטח זה צריך להיות קטן ככל האפשר, אך מייצג את המושבה כולה.

אין לבחור אזורים רבים מדי, שכן הדבר עלול להוביל ליישום מסכה שאינו מדויק. לחץ על כפתור ה-next. בחר ב-Don't want regions על ידי הקפת אזורים שאינם חלק מהמושבה ואינם חלק מהרקע.

באזורים אלו קיימים דפוסים שיש לדכא, כגון שיירי תאים (debris) ותאים מתים. לחץ על הבא. בחר את הרקע על ידי הקפת אזורים שאינם מושבות, שיירי תאים או תאים מתים.

הרקע צריך להיות אחיד וכזה שיופיע בכל פריים. בדרך כלל, נבחר את הרקע האפור מסביב למושבה. לחצו על כפתור ההמשך.

מסכה צבעונית אמורה להיות מוצגת מעל אזור העניין אם המסכה אינה מכסה את אזור העניין באופן מדויק. ניתן להגדיל או להקטין את טווח סף הסגמנטציה בפינה הימנית התחתונה של המסך אם נדרש שינוי במסכה. בחר בעדכון אזורי התאמה רכה (updates soft matching regions).

פעולה זו מאפשרת לשנות את האזורים הרצויים, הבלתי רצויים או אזורי הרקע. אם המסכה מספקת, בחרו ב-"apply threshold" (החלת סף) וב-"save my mask" (שמירת המסכה שלי). לאחר מכן, לחצו על כפתור ההמשך.

לאחר מכן, המסכה תוצג בצבע שונה. בחרו ב-finish. המתכון אמור להופיע בפינה הימנית העליונה של התוכנה תחת segmentation recipe.

שנו את שם המתכון במידת הצורך על ידי לחיצה ימנית והזנת שם חדש. כדי להחיל את המתכון, לחצו לחיצה ימנית והניחו את העכבר מעל.

החל את המתכון. יופיע תפריט המאפשר לבחור את מספר הפריימים לשימוש. הגדר את מרווח הפריימים לכל 20 פריימים כדי להבטיח את דיוק המסכה.

בצעו בדיקה ידנית אקראית של 10% מהפריימים שבהם הוחל המסך, כדי ליצור מתכון שיפור (enhancement recipe) שיסיר אזורים לא רצויים בשאריות (debris). לחצו לחיצה ימנית על תיקיית מתכון השיפור ולאחר מכן לחצו על "חדש" (new). מתכון שיפור חדש אמור להופיע מתוך שדה הראייה המקורי.

העבר את העכבר מעל האייקונים בסרגל הכלים כדי לזהות את כפתור מודול שיפור התצוגה הממוקם מימין לתמונה ולחץ עליו. בחר בתפריט הנפתח של סימון (labeling). בחר בסימון עבור מחובר (connected) ובחר בסימון עבור מחובר שניים (connected two).

סרגל משימות חדש אמור להופיע. גררו את המסכה הראשונית ממתכון הסגמנטציה אל תיבת הקלט. הסרגל אמור להציג כעת את מספר מסכת הקלט.

גררו את האייקון עם מספר מסכת הקלט אל אייקון מסכה אפס. חפשו את min size בסרגל המשימות וכוונו את המספר עד שיוצג רק אזור העניין (region of interest). ודאו שאתם לוחצים על execute עבור כל ניסיון התאמה.

לאחר שהתאמת הגודל המינימלי מספקת, לחצו על מתכון השיפור הקודם בתחתית המסך ובחרו בשמירה למתכון (save to recipe). התוכנה תבקש כעת לדרוס את המתכון הנבחר; בחרו כן (yes spot). בדקו את מתכון השיפור באמצעות אותו הליך המשמש לבדיקת סגמנטציה של נקודות (spot checking segmentation).

אם התוצאות של מתכוני הסגמנטציה והשיפור מספקות, המשיכו ליצירת תבנית המדידה. כדי להתחיל, בחרו ב-create measurement template בסרגל הכלים הימני. בחלון המדידה, בחרו ב-move cursor מעל תא ה-clip art של הדמות.

החזיקו את מקש ה-control ובחרו את התא תחת סעיף המורפולוגיה, בטלו את הסימון של פרמטר ברירת המחדל (default parameter) וסמנו את פרמטר השטח (area parameter). לאחר מכן צאו מחלון התבנית. בחרו את האייקון.

צרו מתכון מדידה. שנו את שם המתכון. עברו ללשונית התבנית ובחרו אותה. בפינה הימנית העליונה, גררו והניחו את תבנית המדידה שנוצרה קודם לכן על חלון המדידה.

לחצו על כן כדי להמשיך בחלון מתכון המדידה, ובחרו את מיפוי הערוצים. לאחר מכן, בחרו את מיפוי המסכות לבחירת תא שלם. לאחר מכן, בחרו באפשרות של תא שלם. עבור מסכה משופרת, בחרו את מתכון המדידה תחת לשונית המתכונים.

בחלון הראשי, בחר בסמל השמירה בתוך חלון מתכון המדידה. לאחר מכן סגור את החלון. בשלב הבא סגור ופתח מחדש את שדה הראייה. לחץ לחיver עם המקש הימני על תיקיית רשימת המתכונים ולאחר מכן לחץ על "חדש", גרור את המתכונים לפי סדר היישום הנדרש אל רשימת המתכונים, בחר בנעילת רשימת המתכונים, והרץ את המתכונים באופן רצית על נתוני הווידאו באמצעות Adobe Photoshop.

כל פריים עשורי של אותן מושבות נותח. פתחו באופן ידני פריים של תמונת מושבה בתוכנת Adobe Photoshop. לחצו על כלי השרביט הקסם (magic wand tool) בסרגל הכלים.

לחץ על האזור שסביב המושבה כך שכל השדה יהיה מכוסה למעט אזור המושבה. ודא שהקו המקווקו סביב המושבה מתאים בדיוק להיקף המושבה ולא בתוכה. אם הקו המקווקו אינו סביב ההיקף, שנה את ערך הסבילות (tolerance) בסרגל הכלים העליון בהתאם.

לחצו על edit במצב quick mask בסרגל הכלים ולחצו על המושבה כך שתהיה נבחרת. עברו לתפריט הנפתח של window ולחצו על histogram. ה-cache צריך להיות מוגדר ל-one.

אם ערך המטמון הוא שתיים, לחצו על סימן הקריאה של הביטוי כדי לשנות את המטמון לאחד. רשמו את ערך הפיקסל בגיליון אלקטרוני. חזרו על התהליך שלעיל עבור כל פריים 20.

ניתן להציג את הנתונים שנאספו באמצעות תוכנת Photoshop ותוכנת CL quant יחד בגרף. הפרוטוקול שלנו לכימות צמיחת מושבות HESC מדגים יישום אחד של ביו-אינפורמטיקה של וידאו לבעיה ביולוגית. כאן אנו מציגים גרף המשווה את העלייה בגודל המושבה לאורך 48 שעות, כפי שנקבע באמצעות תוכנת CL quant ותוכנת adobe Photoshop.

הגרף מציג חמישה מושבות שונות שכל אחת מהן נותחה באמצעות שתי חבילות התוכנה. כל מושבה מיוצגת בצבע שונה. הקווים הרצופים הופקו באמצעות תוכנת sail quant, בעוד שהקווים המקווקווים נאספו באמצעות Photoshop.

הגרף של הנתונים הגולמיים מראה כי שתי שיטות המדידה תואמות היטב, בהתחשב בעובדה שלמושבות יש גודל התחלתי שונה. איור זה מציג את הנתונים ששורטטו מחדש כאחוז העלייה בגודל המושבה. שיעורי הצמיחה דומים ללא קשר לגודל המושבה ההתחלתי, ושתי שיטות הניתוח נותנות תוצאות דומות.

הגרף הבא מציג את הממוצעים של נתוני אחוזי השינוי הקודמים בצמיחת מושבות HESC. גרף זה מראה בבירור התאמה טובה בין הניתוח שבוצע באמצעות ביו-אינפורמטיקה של וידאו לבין Adobe Photoshop. כעת הצגנו בפניכם כיצד למדוד צמיחה של מושבות תאי גזע עובריים אנושיים באמצעות כלי ביו-אינפורמטיקה של וידאו.

בעת ביצוע הליך זה באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast microscopy), יש לוודא שכל ההילה סביב המושבה נכללת, וזאת לצורך בחירה מדויקת של המושבות על ידי התוכנה. חשוב לזכור כי ניתן להשתמש בשיטות אחרות לתרבית, אינקובציה ואיסוף וידאו במקום הפרוטוקול שהדגמנו. ברגע שהמתכונים יפותחו ויעברו תיקוף, הם יבצעו את הניתוח במהירות רבה הרבה יותר ובשונות ניסויית נמוכה יותר מאשר ניתוח ידני.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.