ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin
9 באפריל 2010
מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.
שלום, שמי ריק פסקוואה, סטודנט במעבדה להנדסת תאי גזע כאן במחלקה למדעי הכימיה והחיים באוניברסיטת וירג'יניה קומנוולת'. בסרטון זה, אדגים כיצד המעבדה שלנו משתמשת במכשיר ספין STO זול ומיוצר עצמית כדי ליצור שכבה אחת (monolayer) נצפית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצורך כימות של סממנים על פני השטח של התא. בהינתן שפרוטוקולים אימונוכימיים רבים מותאמים ל-hPSC הגדלים בתוך שקופיות תא (chamber slides) כמושבות, עלולים להיווצר קשיים באפיון הביטוי של הביומארקרים ברמת התא הבודד.
שמירה על התאים בשכבה אחת (monolayer) מסייעת לא רק בניתוח חזותי שלהם, אלא ייתכן שגם בכימות הביטוי שלהם. ניתן להרכיב את מכשיר ה-sinus spin שבו אנו משתמשים במעבדותינו מחומרים הנמצאים ברוב המעבדות; הוא דורש רק דגימת תאים קטנה ואינו זקוק לסוג מסוים של ריאגנט. וחשוב מכך, הוא מסוגל לשחזר באופן מהימן פריסה של תאים בודדים לצורך תצפית. להלן חלק מהדברים שיהיו דרושים לכם כדי להרכיב את מכשיר ה-cytosine.
שקופיות פלסטיק; מכיוון שהן לא חייבות להיות נקיות, ניתן להשתמש בשקופיות תא (chamber slides) ישנות אם תרצו. שקופיות זכוכית שנקו לפני כן. אלו חייבות להיות נקיות כיוון ששם ייווצר השכבה החד-שכבתיות (monolayer) של התאים.
נייר סינון, כל סוג יהיה מתאים, וטיפים לפיפט מיקרו. המעבדה שלנו משתמשת בטיפים של 1 עד 10 µL לפני תחילת הבנייה. ראשית, יש ליצור חורים בתוך השקופיות הפלסטיק.
ניתן לבצע זאת באמצעות מקדחה שולחנית. קוטר החורים תלוי בגודל טיפ המיקרופיפט וצריך להיות בערך ברוחב החלק הרחב ביותר של טיפ המשמש עבור מיקרופיפט סטנדרטי של 1 עד 10 µL. גודל זה צריך להיות סביב שבעה מילימטרים.
מספר החורים שתיצור ב lamellae הפלסטיק תלוי לחלוטין בשימוש המיועד עבורן. עבור צביעה אימונוכימית במעבדה שלנו, לדוגמה, אנו משתמשים בדרך כלל בשני חורים, אחד עבור הצביעה החיובית והשני עבור בקרת רקע שלילית. ניתן להשתמש ב lamellae הללו שוב ושוב מספר בלתי מוגבל של פעמים.
עבור נייר המסנן, פשוט גזרו חתיכה ממנו בהתאם לממדי השקופית הפלסטיקית. השתמשו בחורים שבשקופית כנקודת ייחוס ליצירת חורים בנייר המסנן. גודל החור בנייר המסנן צריך להיות גדול מספיק כדי שראש המיקרופיפטה יוכל להיכנס בצורה הדוקה, כפי שמוצג כאן.
לאחר מכן, יש לחתוך את המספר המתאים של טיפים לפיפט מיקרו, טיפ אחד עבור כל חור, באורך של כחצי מהטיפ. אלו ישמשו כבסיס לזכוכית המיקרוסקופ שבה תיווצר השכבה התאית החד-שכבתית (mono layer). לאחר מכן, יונח נייר סינון מעליהם.
נייר המסנן ישמש לספיגת עודפי מצע מצביעת הסספנסיון. מעליו יונח סרט פלסטיק שישמש כתמיכה המוצקה למכשיר. לאחר מכן ניתן לאטום את ארבעת הצדדים בעזרת סרט הדבקה ביתי רגיל.
לבסוף, מחדירים טיפים של מיקרופיפט שלמים אל תוך הקצוות החתוכים של המכשיר. זהו המקום שבו ימוצבו הדגימות התאיות לאחר הצביעה בסוספנזיה. עשוי להיות מועיל לסמן תחילה את מיקום הקצוות החתוכים על גבי הפסית הזכוכית לצורך זיהוי נוח יותר.
פרוטוקול צביעת התליה אימונוכימית שבו המעבדה שלנו משתמשת כולל תחילה איסוף של תאי גזע לתליה של תאים בודדים, דבר המבוצע בדרך כלל על ידי עיכול אנזימטי, באמצעות trypsin או באמצעות בופרים לדיסוציאציית תאים המבוססים על EDTA שאינם אנזימטיים. התאים מועברים לאחר מכן למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1 ml או 2 ml המכילות את מצע הגדילה הסטנדרטי שלהם. לאחר מכן, אלו עוברים צנטריפוגה ב-200 Gs למשך ארבע דקות.
אותה מהירות צנטריפוגה תשמש לכל שלבי השטיפה וההסמכה (spin down) הבאים. לאחר מכן, שואבים את המצע באופן ידני; יש לנהוג בזהירות רבה בזמן השאיבה כדי להבטיח שמשקע התאים לא יופרע. לאחר מכן שוטפים את המשקע פעמיים עם 1 ml של PBS, כולל הסמכה ושאיבה בכל פעם.
השלב הבא כולל קיבוע של התאים באמצעות פתרון פורמלהיד 4% או PFA; הרכיבים הדרושים להכנתו מפורטים בכתב המלווה לסרטון זה. התאים מדגברים בתמיסת הפורמלהיד 4% ומושארים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מומלץ לבצע שלב זה לפני תליה חוץ-תאית, צביעה או שימוש במכשיר ה-cyto spin.
לאחר מכן, שוטפים את התאים פעמיים ב-PBS כדי להסיר שאריות של PFA. לאחר מכן יש לחסום את התאים כדי למנוע צביעה לא ספציפית. לאחר שטיפות ה-PBS בשלב הקודם, שואבים החוצה את נוזל השטיפה ומוסיפים 1 ml של תמיסת החסימה.
לאחר מכן יש להשאיר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך כ-45 דקות. בזמן ההמתנה לתמיסת החסימה, ניתן להכין את הנוגדן הראשוני על ידי דילויל לריכוז המומלץ בתוך תמיסת החסימה. יש לשמור זאת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שהתאים שהו בתמיסת החסימה למשך כ-45 דקות, סבבו אותם בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל החוצה ושחזרו את השעיה של התאים בתמיסת הנוגדן הראשוני. לצורך זיהוי קישור לא ספציפי ובקרת רקע, מומלץ לשמור לפחות דגימה אחת כביקורת שלילית, שבה לא הוחל נוגדן ראשוני והיא פשוט הושעה מחדש ב-PBS.
כל הדגימות מובלעות בטמפרטורת החדר למשך כשעה אחת. במידת הצורך, ניתן להשאיר תאים מקובעים בסוספנזיה בתמיסת הנוגדן הראשוני למשך הלילה ולשטוף אותם פעמיים בתמיסת חסימה. ניתן להכין את תמיסת הנוגדן המשני בזמן ביצוע השטיפה.
נוגדנים שניים הם בדרך כלל רגישים לאור, לכן במידת האפשר יש להחשיך את תאורת המעבדה ולכסות כל מכלי עבודה ברדיד אלומיניום; פעולה זו נועדה למנוע הלבנה של הפלואורסצנציה. ניתן לשלב ריאגנטים מסוג Antifa בפרוטוקול, אך יש לנקוט זהירות בשימוש בהם שכן הם עלולים לגרום לרקע גבוה יותר, בדומה לנוגדן ראשוני המדולל לריכוז המומלץ בתמיסת החסימה. יש להחיל נוגדן שני על כל הדגימות, בין אם הוסף להן נוגדן ראשוני ובין אם לאו, לאחר סיום השטיפה.
השאירו את הדגימה במקום חשוך, כגון בתוך צנצנת, למשך כשעה. שטפו את התאים פעמיים עם 1 ml של תמיסת חסימה (blocking solution). התאים אמורים להיות מוכנים כעת לצביעת גרעין באמצעות צבע DPI.
הכינו תחיל DPI בדילול של 1 ל-10,000 ב-PBS בתחילה, שטפו את התאים ב-1 ml של PBS פעם אחת, לאחר מכן השעיו אותם ב-dpi, והניחו להם לעמוד בטמפרטורת החדר למשך כ-5 עד 10 דקות. בדומה לנוגדן המשני, DAPI רגיש לאור, לכן בצעו את ההתאמות הנדרשות כדי למנוע הבהרה פלואורסצנטית. שטפו פעם אחת עם 1 ml של PBS ולבסוף, השעיו מחדש.
ששעו שוב ב-1 ml של PBS. הפיתרון אמור להיות מוכן כעת לשימוש במכשיר cyto spin. העבירו כמות של עד 100 µl של תמיסת התאים הבודדים לחלק העליון של קצות הפפטות המיקרוסקופיות.
עם זאת, מומלץ להשתמש בכמות נמוכה יותר כדי למנוע גלישה או טפטוף מיותרים. לאחר מכן, מקמו את מכשיר ה-cytospin ואת המשקולת המאזנת בצנטריפוגה שולחנית וסובבו במהירות של 1000 RPM למשך ארבע דקות. לאחר מכן, פרקו בזהירות את מכשיר ה-cytospin באופן שימזער את הסיכוי להסרת התאים מהשקופית.
יש לוודא שהתרחשה השקעה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה לפני ההרכבה. אלו תמונות של שכבה אחת של תאי BG one V שנצבעו עם ארבעה סממני פני שטח של תאים מסוג SSCA ממכשיר ה-cyto spin. שימו לב עד כמה התאים מבודדים זה מזה, מה שמאפשר ביצוע תצפיות ותיעוד של תאים בודדים.
היתרון של פרוטוקול זה הוא היכולת לשחזר שכבת תאים חד-שכבתיות (monolayer) באופן בר-ביצוע, חסכוני וקל להתאמה לכל ניתוח שגרתי של תרביות תאי גזע. לאור זאת, אני מקווה שתפיקו תועלת מסרטון זה ותמצאו את הפרוטוקול שימושי במחקריכם own.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את השימוש במכשיר cytospin שהוכן באופן עצמאי לצורך צביעה אימונוציטוכימית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). השיטה מאפשרת יצירה של שכבה אחת של תאים (monolayer), דבר המקל על התצפית והכימות של סמני פני השטח של התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת תאי גזע
- אימונוציטוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) הם חיוניים ליישומים מחקריים שונים.
- פרוטוקולים אימונוכימיים סטנדרטיים נתקלים לעיתים קרובות באתגרים כאשר הם מיושמים על hPSCs הגדלים במושבות.
- אפיון של סמנים ביולוגיים ברמת התא הבודד חיוני לצורך ניתוח מדויק.
- שכבה אחת של תאים (monolayer) משפרת את הניתוח הוויזואלי ואת הכימות של סמני שטח התא.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה חסכונית להכנת hPSCs לצורך אנליזה.
- לשפר את מהימנות התצפית והכימות של סמני שטח התא.
- לספק טכניקה הניתנת לשחזור תוך שימוש בחומרים זמינים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של מכשיר cytospin מתוכנן עצמית.
- הכנת שכבה אחת (monolayer) של hPSCs.
- צביעה אימונוסייטוכימית לסממני פני השטח של התא (SSEA-3/SSEA-4).
- כימות ותצפית על תאים צבועים.
תוצאות עיקריות
- מכשיר ה-cytospin יוצר ביעילות שכבה אחת (monolayer) של hPSCs.
- ניתן לצפות ולכמת באופן מהימן סממנים על פני השטח של התאים.
- השיטה היא הדירה ואינה דורשת ריאגנטים ספציפיים.
- הניתוח הוויזואלי של תאים בודדים משופר.
מסקנות
- מכשיר הציטוספין (cytospin) שהורכב באופן עצמאי הוא כלי בעל ערך למחקר תאי גזע.
- שיטה זו נותנת מענה לאתגרים בניתוח אימונוציטוכמי של hPSCs.
- יישומים עתידיים עשויים להפיק תועלת מגישה זו במסגרות מחקר שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
אפיון של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ברזולוציה של תא בודד הוא קריטי לתיקוף מטרות ולפיתוח בדיקות בשלבי הגילוי המוקדמים. שיטת ה-cytospin שהוכנה במעבדה זו מאפשרת הכנה רבדית (monolayer) הניתנת לשחזור, התומכת בניתוח אימונו-ציטוכימי כמותי של סממנים שטחיים כגון SSEA-3/SSEA-4. גישה זו מפחיתה שונות טכנית ומגבירה את הביטחון החזוי במודלים מבוססי תאי גזע המשמשים להערכת סיכונים מכניסטית (mechanistic de-risking) ולזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות סמנים ביולוגיים (biomarkers) ברזולוציית תא בודד במושבות של hPSC.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבהרת דפוסי הביטוי של סמני פלוריפוטנציה ברזולוציית תא בודד.
- ערך חיזוי: משפר את מוכנות הבדיקה לסריקות המשך על ידי יצירת שכבות תאים (monolayers) עקביות וניתנות לצפייה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות על ידי הבטחת פיזור תאים אחיד ונגישות לסמנים.
- ערך תפעולי: שיפור הסטנדרטיזציה והשחזור של הבדיקה באמצעות עיבוד cytospin מבוקר ותלות מינימלית בריאגנטים.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור תנאי צביעה מרובים באמצעות רכיבי מכשור בעלות נמוכה הניתנים לשימוש חוזר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על נאמנות פנוטיפית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי שימור שלם התא במהלך היווצרות השכבה החד-שכבתיות (monolayer).
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מקלה על קורלציה בין ביטוי של סממני שטח לבין פוטנציאל דיפרנציאציה במערכות הרלוונטיות למחלה.
- החלטות מותאמות סיכון: תומכת בקריטריונים של קבלת החלטה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ברמת התא הבודד להערכת פלוריפוטנציות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת הכנה מהימנה של hPSCs לניתוח אימונוציטוכימי, ובכך מגשרת בין תרבית מבוססת מושבות לבין בדיקות ברזולוציית תא בודד.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לכמות מדויקת של סמני פלוריפוטנציות בתאים בודדים.
- סריקה: מספק שכבות מונו-שכבתיות (monolayers) מוכנות לבדיקה עם הדירות גבוהה, ובכך מפחית שונות שגויה בזיהוי סמנים.
- אנליטיקה: מייצר פלטי הדמיה כמותיים (למשל, עוצמת פלואורסצנציה לתא) המאפשרים השוואה אובייקטיבית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי הבטחת אפיוני פנוטיפ עקביים של מודלים המופקים מ-hPSC.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת מודולרית וחסכונית לבקרת איכות שגרתית של תאי גזע על פני פרויקטים ואתרים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהערכת הפלוריפוטנטיות.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות בנייה פשוטה ורכיבים לשימוש חוזר.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אפשור דירוג מדויק של סממנים ביולוגיים המבוסס על תא בודד.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של שורות תאי גזע על בסיס פרופילי ביטוי מדידים של סממנים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בסיסית בתרביות תאים ובמיקרוסקופיה להכנת תרחיף ולדימיון פלואורסצנטי.
- נדרשת גישה לצנטריפוגה שולחנית וציוד מעבדה סטנדרטי (שקופיות זכוכית, נייר מסנן, טיפים לפיפטה, סרט דביק).
- נדרש סטנדורט של מהירות סבב, משך זמן ונפח דגימה בין המשתמשים השונים כדי להבטיח יצירה רפרודוקטיבית של שכבה אחת (monolayer).
- התאמה לסוגי תאים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הדיסוציאציה והחסימה (blocking).
- מתאים לתאים בעלי יכולת היצמדות בלבד; לא מתאים לתרחיפי תאים ראשוניים שאינם נצמדים או לתאים שבירים ללא ביצוע התאמות.
