האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח
15 ביוני 2010
מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפריד ולהשוות בין פראקציית המונו-זומים (mono zone) ופראקציית הפולי-ריבLוזומים מליזאטים של תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול התאים הרלוונטיים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הכנת ליזאט התאים.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא סבוב (centrifugation) של הליזאט דרך מדרג סוכרוז. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הפרדה של המדרג לשברים (fractionation) וויזואליזציה של האוכלוסיות הריבוזומליות השונות באמצעות מעקב UV. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בתרגום תחת תנאים ניסיוניים שונים באמצעות ניתוח פרופיל פוליריבוסומים.
שלום, אני אנטוני אספוזיטו מהמעבדה של ד"ר טרי גוס קינזי במחלקה לגנטיקה מולקולרית, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ב-UMD ובבית הספר לרפואה J Robert Wood Johnson. ואני מרקוס לואיס, גם אני ממעבדת קינזי כאן ב-R-W-J-M-S.
היום נדגים לכם פרוצדורה לניתוח פוליריבוזומים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים בסינתזת חלבונים הנובעים ממוטציות או מגורמים סביבתיים. אז בואו נתחיל. סוכרוז.
יש להכין את המדרגות יום אחד לפני השימוש כדי לאפשר למדרגות להפוך לרציפות. ערבבו את הנפחים המתאימים של תמיסות מלאי של סוכרוז בריכוז 7% ו-47% כדי להכין 48 מיליליטרים מכל אחד מהריכוזים הבאים של סוכרוז: 7%, 17%, 27%, 37% ו-47%. הוסיפו DTT בריכוז אחד מולרי לכל תמיסת סוכרוז עד לריכוז סופי של one millimolar. כדי למזוג את המדרגות, חברו פיפטת פסטה למזרק של 20 מיליליטר על ידי קיבוע ואיטום עם para film.
הוסיפו שבעה מיליליטרים של sucrose בריכוז 7% לתחתית של מבחנה צנטריפוגה polyamer ultra בגודל של אינץ' אחד על 3.5 אינץ'. לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיליליטרים של תמיסת sucrose בריכוז 17% מתחת לתמיסה של 7%, על ידי הנחת קצה הפ pipette (פסטה) קרוב לתחתית המבחנה והזרמה איטית. מזיגת כל שכבה צריכה להימשך לא פחות מ-20 שניות.
חזור על הפעולה עם שבעה מיליליטרים של תמיסות סוכרוז בריכוזים של 27%, 37% ו-47%, לאחר שהמדרג נוצר. אתה אמור להבחין בקווים ברורים בין השכבות המעידים על ערבוב מינימלי. אחסן את כל המדרגים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה, יחד עם הרוטורים, הבקבוקים והמבחנות שישמשו לאיסוף הדגימות.
כדי להכין תמציות מתאי שמרים, התחילו בגידול של 100 מלקחים של 25 milliliters של תרבית שמרים עד ל-OD 600 של 0.8 עד 1. הוסיפו cyclo heide לתרבית לריכוז סופי של 100 µg/mL והמשיכו לנער בטמפרטורה של 30 °C למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, שפכו את התרבית לבקבוק צנטריפוגה של 250 milliliter ומלאו בקרח.
שמרו את כל החומרים על קרח מהשלבนี้ ואילך; סבבו בצנטריפוגה ב-8,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השעו את המשקע ב-10 milliliters של lysis buffer קר, והעבירו למבחנות פוליפרופילן של 15 milliliters. סבבו בצנטריפוגה ב-5,900 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השעו.
שששו את המשקע ב-0.5 milliliters של lysis buffer. העבירו את התוךיה לתוך micro fuge tube בנפח 1.5 milliliter ולאחר מכן הוסיפו 0.5 milliliters של chilled baked acid washed glass beads. ערבבו את התאים ב-Vortex בארבעה מרווחים של 32 שניות, כאשר השפופרה מונחת על קרח למשך 30 שניות בין כל מרווח.
לאחר מכן, הוסיפו עוד 0.5 milliliters של lysis buffer לשפופרת הצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter וסבבו ב-5,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העלייה (supernatant) לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 milliliter וסבבו במהירות מרבית למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.
לבסוף, העבירו את הנוזל העליון למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 milliliter. ניתן לשמור את התמצית בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לפני העברת הליזאט למדרג הסוכרוז. הניחו את קצה הפ pipette כנגד דופן המבחנה, קרוב לפני השטח של המדרג, והניחו בעדינות את הליזאט מעל המדרג.
עבור גרדיאנט של 35 milliliter, טוענים בדרך כלל 500 microliters של ליזאט. בעזרת פינצטה, השקיעו בזהירות את הגרדיאנט לתוך הסל של רוטור בעל סלים מתנדנדים (swinging bucket rotor). סובבו את הגרדיאנטים בצנטריפוגה ב-100,000 times gravity למשך ארבע שעות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius.
בערך 30 דקות לפני השלמת הסבב בן ארבע השעות. חברו את המחט למנקב הפעולות (tube piercer) ואת העט למסך ניטור הספיגה והפלואורסצנציה המחובר למערכת. הפעילו את אספקת הכוח למסך הספיגה כדי לאפשר הגעה לקו בסיס יציב לפני ניתוח הדגימות.
ניתן להשיג בקלות רכישה אלקטרונית של פרופיל ה-PolyZone בזמן אמת על ידי חיבור יחידת רכישת נתונים DI 1 48 U. עבור רשם התרשים, מלא את משאבת המזרק ב-50 milliliters של florin nuts באמצעות הגדרת זרימה הפוכה מהירה. ודא כי אין בועות אוויר.
חברו את הצינור מהמזרק למנקב הצינורות (tube piercer). הפעילו לזמן קצר את זרימת ה-Flo inert בקצב של six milliliters per minute בכיוון קדימה. כדי לנקות את הצינור מבועות אוויר, הניחו סדרה של מבחנות מתחת לצינור בקצה תא הזרימה (flow cell) כדי לאסוף את נוזל הניקוז.
הכינו דלי קרח עם שקע מוכן מראש להחזקת מבחנת הצנטריפוגה המכילה את מדרג הסוכרוז. עם סיום הסבב של ארבע שעות בצנטריפוגה, הוציאו בזהירות את מבחנות הצנטריפוגה מהרוטור של הצנטריפוגה והניחו אותן על קרח, תוך הקפדה לא להפר את המדרגים.
כדי לנתח תמריתי תאים, הנח את מבחנת הגרדיאנט על מחורר המבחנות, חבר את חלקו העליון של המבחנה ליציאה והדק אותה. הרם את הבמה התחתונה אל מבחנת הצנטריפוגה כך שהמחט תדקור את תחתית המבחנה. התחל את זרימת ה-Florin alert בכיוון קדימה בקצב של six milliliters per minute.
ברגע שהנוזל החל לזרום אל תוך המבחנה, עקוב אחר תנועת המחט במד בליעת ה-UV המקוון. ברגע שהמחט מתחילה לזוז, הפעל את תנועת התרשים להגדרת מהירות של 60. כאשר הגעת לסוף פרופיל הפוליריבוסומים, הפסק את זרימת ה-Flo inert למבחנת הצנטריפוגה ועצור את תנועת התרשים במד בליעת הפלואורסצנציה.
סחבו את ה-Flo inert מתוך מבחנת הצנטריפוגה אל תוך המזרק על ידי הפעלת הזרימה בכיוון ההפוך בקצב מהיר, תוך הקפדה שלא לשאוב סוכרוז מהמבחנה אל תוך המזרק. שחררו את מבחנת הצנטריפוגה מהמנקב (tube piercer), הורידו את המחט והוציאו את המבחנה. כאן מוצג תרשים מייצג של תמצית ריבוזומים שהוכנה משמרים בנוכחות cyclo heide.
מוצגים שיאי בליעת UV המכילים פוליריבוזומים וריבוזומים של 60 s ו-40 s. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע אנליזה של פוליריבוזומים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות, לשמור על הדגימות קרות ולהבטיח שמיגש ה-RNAs יהיה נקי מזיהומים.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי ריבוזומים מתרגמים מתאי אוקריוטים, המאפשר ניתוח של אוכלוסיות ריבוזומליות שונות. השיטה כוללת הפרדה של ריבוזומים למונוסומים ופוליריבוזומים באמצעות פרקציונציה במעגלי סוכרוז, דבר החיוני לחקר הבקרה על התרגום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- הבנת תפקוד הריבוסום היא קריטית לחקר סינתזת חלבונים.
- פרופיל פוליריבוסומים מספק תובנות לגבי בקרה על התרגום.
- טכניקות להוצאת ריבוסומים הן בסיסיות במחקר ביולוגיה מולקולרית.
- גורמים סביבתיים ומוטציות יכולים לשנות את סינתזת החלבונים.
מטרת המחקר
- להפרדה ולהשוואה של פראקציות של מונו- ופוליריבוזומים מליזאטים של תאים.
- לוויזואליזציה של אוכלוסיות ריבוזומליות שונות באמצעות מעקב UV.
- לניתוח שינויים בתרגום תחת תנאים ניסיוניים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תאי איקריוטים והכנת ליזאטים של תאים.
- צנטריפוגה דרך מדרג סוכרוז.
- פרקציונציה של המדרג לבידוד אוכלוסיות ריבוזומליות.
- ויזואליזציה של פרופילים ריבוזומליים באמצעות ניטור בליעה של UV.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של מונוסומים ופוליריבוזומים.
- ויזואליזציה ברורה של אוכלוסיות ריבוזומליות באמצעות מעקב UV.
- ניתוח של בקרה על התרגום בתנאים שונים.
- תובנות לגבי השפעת מוטציות על סינתזת חלבונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מהווה תקן זהב לחקר ויסות התרגום.
- הוא מאפשר לחוקרים לנתח ביעילות את הדינמיקה הריבוסומלית.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים המולקולריים של התרגום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח פרופיל פוליריבוסומים מאפשר לצוותי ביו-פרמה לחקור מנגנוני בקרה תרגומית ולזהות פגמים בסינתזת חלבונים בנקודות הכרעה קריטיות בשלב הגילוי. שיטה זו מספקת תובנה כמותית לגבי תרגום גלובלי ותרגום ספציפי לטרנסקריפט, ובכך תומכת בביטחון ניבוי באישור מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים. יכולתה להסתגל למערכות אוקריוטיות שונות מבטיחה רלוונטיות רחבה עבור תיקי פיתוח בשלבי מו"פ מוקדמים ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של בקרה תרגומית תחת הפרעות גנטיות או סביבתיות.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין פגמים בשלב הפתיחה לבין פגמים בשלבי ההארכה או הסיום.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות שינויים ביחסים בין פוליריבוסומים למונוסומים.
- מספק פלטפורמה להערכת ההשפעה של התערבויות מועמדות על סינתזת חלבונים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק קריאות כמותיות ומאומתות של מעורבות ריבוסומלית לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר פרקציונציה הדירה וזיהוי מבוסס UV של אוכלוסיות ריבוסומליות.
- מכין תמריות ביולוגיות המתאימות לתהליכי עבודה של ניתוח mRNA או חלבונים בשלבים הבאים.
- תומך בסריקה של תרכובים המווסתים את מנגנון התרגום או מסלולים רגולטוריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את גילוי הסמנים הביולוגיים התרגומיים לתובנות מכניסטיות על ויסות סינתזת חלבונים.
- מבטיחה רצף ממודלים תאיים למערכות פרה-קליניות על ידי התאמת פרוטוקולים בין מינים אוקריוטיים.
- מספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת פגמים תרגומיים הקשורים למודלים של מחלות.
- מספקת הקשר מכניסטי לפנוטיפים שנצפו במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורי עיבוד
פרופיל פוליריבוזומים (Polyribosome profiling) משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערות של התרגום, ובכך תומך הן בתיקוף המטרה (target validation) והן בזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיית גילוי: מכמת את התוצר התרגומי ומבהיר מנגנוני בקרה ספציפיים למסלול.
- סריקה: מציעה הפרדה כמותית חסונה ותוצרי בליעת UV לצורך מוכנות לבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת מדידה כמותית בזמן אמת של אוכלוסיות ריבוזומליות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מודלים תאיים ופרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להתאמת פרוטוקולים וסנכרון ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית למחקרים תרגומיים ומכניסטיים מגוונים בתוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי בקרה תרגומית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של מיצוי, פרקציונציה וזיהוי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי חשיפת צווארי בקבוק תרגומיים ותמיכה במיון יעיל של תיק הפיתוח מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות ומודלים מותאם סיכון על בסיס נאמנות תרגומית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של ריבוזומים ובטכניקות של פרקציונציה במדרג ריכוזים (gradient fractionation).
- מחייב גישה למכשירים לאולטרה-צנטריפוגה ולמדידת בליעה ב-UV.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להשגת תוצאות הדירות.
- ניתן להתאמה למערכות של שמרים ויונקים עם שינויים בפרוטוקול לפי הצורך.
- שלמות הדגימה ותנאים נקיים מ-RNase הם קריטיים לקבלת תוצאות מהימנות.
