התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte
19 במאי 2010
אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת "מתחזקים" בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק תאי קדם-אוליגודנדרוציטים מתאי גזע עובריים באמצעות סדרה של שלבי תרבית לאורך 30 יום. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת גופי עובריים (embryo bodies) מתאי ES של עכבר כדי להתחיל את התמיינות התאים. כשלב שני, גופי העובריים מטופלים במולקולות קטנות, רטינואיד (retinoic acid) ומורפין טהור, המשרים התמיינות מכוונת של התאים לתאי קדם-אוליגודנדרוציטים.
תאי קדם-Cyte. כשלב שלישי, גופי העובר מופרדים לתאים בודדים לאחר 22 ימים נוספים. בתרבית, כ-80% מהתאים הם OPCs.
בשלב הבא, תאי OPC המופקים מ-MESC עוברים טרנסדוקציה באמצעות וירוסי bao הנושאים את תת-היחידה NAV 1.2 במטרה לייצר תאי OPC בעלי יכולת ירי (spiking). התוצאות המתקבלות מראות את הביטוי של סמן OPC ותכונות ה-spiking של תאי OBC אלו המופקים מ-MESC, בהתבסס על מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה והקלטות אלקטרופיזיולוגיות. שלום, אני פונג צ'יאנג מהמעבדה של ד"ר אינג במחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה אנושית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. אנו קשורים גם לבית החולים שרינרס לילדים של צפון קליפורניה.
שלום, אני ויאל רג' (vial Raj), גם אני מהמעבדה של דנג (Deng lab). היום נדגים לכם פרוטוקול לגביעת תאי גזע עובריים של עכבר לתאי אב של גליאל. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תכונותיהם של תאי אב לאוליגודנדרוציטים הגזורים מתאי גזע עובריים, במטרה לייצר תאים בעלי פוטנציאל טיפולי טוב יותר.
אם כן, בואו נתחיל. היום נוצר תאי אב של אוליגודנדרוציטים (OPCs) מקו תאי גזע עובריים של עכבר מסוג OG2-GFP. יש להעביר תאי גזע עובריים אלה (passage) מדי שלושה ימים כדי לשמור על בריאותם בצפיפות אופטימלית ולמנוע דיפרנציאציה ספונטנית. העברה.
תאי ה-ESS כאשר הם נמצאים ב-70% confluence תחת מנדף זרימה למינרית. הסר את המצע שמעל התרבית. שטוף עם PBS ובצע trypsinization עם שני מיליליטר של תמיסה שחוממה מראש.
בצע סבב אחד של LE express למשך חמש דקות ב-37 °C. עצור את התגובה והשהה מחדש את התאים בארבעה מיליליטר של מצע תאים MES. העבר את התאים למבחנה קונית של 15 מיליליטר והשק אותם ב-1000 RP למשך חמש דקות.
השביו מחדש בצלחת עם מצע MESL, עשירית מהתאים מעל שכבה צפופה (confluent) של תאי הזנה מסוג meth שהוקרנו, במצע תאי MES. לאחר שלושה ימים, תאי ה-ES מגיעים לכ-70% צפיפות והם מוכנים למעבר (passage) או להשביה מחדש ליצירת גופי עובר (embryoid bodies) כדי להשרות היווצרות גופי עובר ולהתחיל בדיפרנציאציה. בצעו טריפסינציה לקולוניות תאי ES של עכבר כפי שבוצע בעבר, ולאחר מכן השביו את התאים מחדש במצע knockout serum replacement או במצע KSR. ספרו את התאי באמצעות הโมסיציטומטר (hemocytometer), ודללו את התרחיף ב-KSR.
דללו את המדיום כך שיכיל 15,000 תאים למיליליטר, והעבירו שלושה מיליליטרים לכל באער של פלטת 6 באערים עם הידבקות נמוכה במיוחד (ultralow attachment). תרבתו את התאים התלויים ב-37 °C למשך ארבעה ימים. החליפו את המדיום באופן מלא מדי יומיים.
החל מהיום הרביעי, החליפו את המצע מדי יום; ביום הרביעי הוסיפו ל-KSR חומצה רטינואית בריכוז 0.2 µM. ביום החמישי הוסיפו הן חומצה רטינואית והן primor famine בריכוז 1 µM; בימים השישי והשביעי השכילו את גופי העוברים במצעים המכילים 0.2 µM חומצה רטינואית ו-1 µM primor famine. לאחר שמונה ימים בתרבית, רוב גופי העוברים מביעים GFP ומוכנים לפירוק באמצעות טריפסין; ספרו את התאים כפי שבוצע בעבר.
לאחר מכן, השהו אותם בריכוז של 3.5 × 10⁵ תאים למילליטר. בתוך מצע OPC, העבירו שלושה מילליטרים של התרחף למצע OPC. בשימוש בצלחות של 60 מילימטר מצופות פולי-אורניתין, התאים יהיו קונפלואנטים בערך מדי שבוע ויראו כך; בצעו מעבר לתאים כפי שנעשה קודם לכן עם טריפסינזציה של שלוש דקות.
30 ימים לאחר השעיה ראשונית של ה-resus. במצע KSR, התאים מראים מאפיינים של תאי מקור לאוליגודנדרוציטים ליצירת OPCs בעלי פוטנציאל פעולה (spiking OPCs). השתמש ב-OPCs המופקים מ-ESL של עכבר שנמצאים ברמת התלכדות של בין 50% ל-70%.
החליפו את המצע ב-XPBS כדי לשטוף את התאים. להחדרת תת-יחידה alpha של תעלת נתרון מופעלת מתח 1.2.
אנו משתמשים בערכה לערוצי נתרן of back MAM. ערבבו 1 mL של רכיב A מ-back MAM עם 4 mL של 1X PBS. הסירו את שטיפת ה-PBS והוסיפו את הרכיב המדולל.
דגירה ב-37 °C למשך שעתיים. החלף את סוכן הזיכרון האחורי במצע OPC המועשר ברכיבים B ו-C כפי שמתואר בערכה. דגירה למשך שעתיים נוספות ב-37 °C.
לאחר הדגירה, החליפו את המדיום המועשר במדיום OPC טרי. לאחר 24 שעות נוספות של תרבית, ניתן לבדוק את ה-OPCs שהופקו מ-ESL לאיתור spiking בנקודת זמן זו. ה-EBS אינם מראים פלואורסצנציית GFP.
ה-EBS מראים ביטוי חזק של GFP והם מוכנים לתרבית של פירוק (disaggregation culturing) כ-30 יום לאחר התלייה המקורית. במצע KSR, רוב התאים הם חיוביים אימונולוגית לצביעת NG2, דבר העולה בקנה אחד עם ביטוי ה-GFP. עם זאת, בניגוד ל-OPCs מהמוח, תאי OPCs אלו המופקים מתאי MES אינם מסוגלים לייצר פוטנציאלי פעולה, גם כאשר התאים דפולריזו ל-0 millivolts.
לאחר הכנסת תת-יחידה של NAV 1.2 באמצעות טרנסדוקציה נגיפית, תאי OPC אלו, שנגזרים מתאי MES, נBecoming מעוררים ויורים פוטנציאלי פעולה. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להבדיל תאי גזע עובריים של עכבר לתאי OPC וליצור תאי OPC בעלי יכולת ירי (spiking) באמצעות טרנסדוקציה נגיפית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאחסן את ה-retinoid acid, ה-morphine וה-FGF two בצורה נאותה ולהשתמש תמיד במנת עבודה (aliquot) טריה, ולהשליך כל שארית של retinoid acid לאחר השימוש.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להגזירה של תאי גזע עובריים של עכבר לתאי מקור של אוליגודנדרוციטים (OPCs) באמצעות מולקולות קטנות. השיטה משיגה יעילות גבוהה ביצירת OPCs מסוג +Olig2+NG2 בתוך 30 ימים, וכוללת טכניקה להפקת OPCs "ספייקינג" (spiking) המסוגלים להפיק פוטנציאלי פעולה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע
רקע
- תאי מוצא של אוליגודנדרוציטים (OPCs) חיוניים למיאלינציה במערכת העצבים המרכזית.
- ניתן לגזור תאי גזע עובריים של עכבר (ES cells) לתאי OPCs למטרות מחקר וטיפול.
- מולקולות קטנות יכולות להכווין את תהליך הגזירה ביעילות.
- הבנת תכונות ה-OPC יכולה להגביר את הפוטנציאל הטיפולי בהפרעות נוירולוגיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להפקת OPCs מתאי ES של עכבר.
- בדיקת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של OPCs מבדלים.
- בחינת הפוטנציאל של OPCs בעלי פעילות חשמלית (spiking) עבור יישומים טיפוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גופים עובריים נוצרים מתאי ES של עכבר כדי להתחיל את תהליך הדיפרנציאציה.
- מולקולות קטנות, כולל רטינואיק אסיד ומורפין טהור, משמשות להשראת דיפרנציאציה.
- התאים מופרדים ומגודלים כדי להעשיר את אוכלוסיית ה-OPCs.
- טרנסדוקציה ויראלית משמשת להחדרת תעלות נתרן תלויות-מתח לתוך OPCs.
תוצאות עיקריות
- כ-80% מהתאים המטופחים מזוהים כ-OPCs לאחר 30 ימים.
- מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה מאשרת את הביטוי של סממני OPC.
- רישומי אלקטרופיזיולוגיים מדגימים את תכונות הפעימה (spiking properties) של OPCs שעברו טרנסדוקציה.
- OPCs שלא עברו טרנסדוקציה אינם מראים פוטנציאלי פעולה, דבר המדגיש את יעילות שיטת הטרנסדוקציה הוויראלית.
מסקנות
- הפרוטוקול מייצר ביעילות OPCs מתאי גזע עובריים של עכבר.
- טרנסדוקציה ויראלית ממירה בהצלחה OPCs לתאים בעלי פוטנציאל פעולה (spiking cells).
- שיטה זו מספקת תשתית לחקר OPCs בהקשר של מחקר וטיפול נוירולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גבייה יעילה של תאי גזע עובריים לתאי אב של אוליגודנדרוციטים (OPCs) נותנת מענה לצורך קריטי במקורות תאים הניתנים להרחבה ומחויבים לשושלת תאיות במחקרי רגנרציה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). פרוטוקול זה מאפשר ייצור בתפוקה גבוהה של OPCs המוגדרים פנוטיפית, ובכך תומך ברמת ביטחון חזויה בשלבי תיקוף מוקדמים של מטרות ובמחקרים פונקציונליים. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובמיון תיקי פיתוח עבור אסטרטגיות טיפוליות מבוססות תאים המכוונות למחלות דמיליניזציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מחויבות לשושלת אוליגודנדרוגלית וספציפיות של מסלולים באמצעות סממנים מולקולריים מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי יצירת OPCs עם פרופילי ביטוי עקביים של Olig2 ו-NG2.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי באישור של מטרות פונקציונליות באמצעות אפיון אלקטרופיזיולוגי של תתי-אוכלוסיות של OPCs.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מקור הדיר במצב שחזור של OPCs מאושרים עבור סריקת תרכובות ובדיקות פנוטיפיות המשך.
- מסטנדרט את תוצרי הדיפרנציאציה, ובכך מבטיח פיתוח בדיקות כמותי וניתן להרחבה.
- מאפשר הערכה מהימנה של מולקולות מועמדות במערכות של שושלת אוליגודנדרוציטים הרלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרנת מודלים של OPC in vitro עם פנוטיפים שמקורם ברקמה ראשונית לצורך המשכיות תרגומית.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אפשור מחקרים פונקציונליים על OPCs מסוג spiking ו-nonspiking.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנונית עבור מועמדים בקו הייצור של טיפול תאי המכוונים לדמיאלינציה.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול דיפרנציאציה זה משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר תיקוף מוקדם של מטרות, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי על ביולוגיה של OPC.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי התחייבות שושלת ותכונות תפקודיות של OPC.
- סינון (Screening): מספק אוכלוסיות OPC סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור פלטפורמות של בדיקות כמותיות.
- אנליטיקה: מספק תוצרי אימונופלואורסצנציה ותוצרי אלקטרופיזיולוגיה לצורך ניתוח השוואתי של תתי-סוגים של OPC.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro לבין מודלים של רקמה ראשונית לצורך התאמה פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר ליצירת OPCs במספר תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים המתמקדים ב-OPC.
- ערך תפעולי: מספק ייצור סטנדרטי, ניתן להרחבה וניתן לשחזור של OPC עבור תהליכי עבודה בין-צוותיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתיקי פיתוח של תרפיה תאית ונוירו-רגנרציה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של מועמדים לטיפולים מבוססי OPC.
שיקולים ליישום
- דורש מיומנות בתרביות של תאי גזע, דיפרנציאציה וטכניקות של טרנסדוקציה ויראלית.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה ותשתית להקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי דיפרנציאציה ובדיקה בין צוותים שונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור קווי תאי גזע עובריים שונים או מודלים ספציפיים למין.
- תלוי באיכות עקבית של הריאגנטים ובתזמון מדויק של שלבי הדיפרנציאציה.
