Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי
1 ביולי 2010
בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של תאים במבחנה באמצעות שיטה הדבקות שונה באמצעות electroporation ואת גילוי מאוחר של ראיה התאים התמזגו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מיזוג חשמלי (Electro fusion) כולל יישום של פולסים חשמליים קצרים במתח גבוה על תאים הנמצאים במגע הדוק. בסרטון זה, אנו מדגימים מיזוג חשמלי של תאים in vitro באמצעות שיטת היצמדות (Adherence Method) שונה. הניסויים בוצעו בתאי מלנומה של עכבר, BF one.
עבור הניסוי, פעל לפי השלבים הבאים. גדל תאים בשני מבקחורי תרבית נפרדים עד להגעה ל-80% confluence. בנפרד, הוסף 2.1 µL מכל אחד מתמיסות המלאי.
10 מילימולר C-M-F-D-A או CMRA בהתאמה לשלושה מיליליטר של Krebs Hess Buffer בתוך מבחנה לצנטריפוגה. שטפו את התאים פעמיים ב-Krebs Hess buffer ולאחר מכן הכניסו את תמיסות הטעינה לבקבוקים. תמיסות הטעינה מכילות בערך שבעה מיקרומולר C-M-F-D-A או CMRA בהתאמה.
דגרו את התאים למשך 30 דקות באטמוספירה מבוקרת. במהלך דגירה ראשונה זו, חומרים חודרים בחופשיות דרך קרומי התאים אל תוך הציטוזול, שם הם הופכים לתוצרי תגובה חדירים לקרומי IMP. לאחר דגירה ראשונה זו, שטפו ולאחר מכן דגרו את התאים עם מצע גידול למשך שעתיים נוספות.
את התאים בוחנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמת CCD מקוררת בתוכנת הרכישה. הגדירו את אורך גל העירור ל-548 nanometers ובחרו מסנן band pass מתאים לתמונת פלואורסצנציה של תאים הטעונים ב-CMRA. עבור תאים הטעונים ב-C-M-F-D-A, הגדירו את אורך גל העירור ל-492 nanometers ובחרו מסנן band pass לתמונת פלואורסצנציה ירוקה. ספרו את התאים בשני הבקרוחים וערבבו תאים אדומים וירוקים יחד ביחס של אחד לאחד, והתאימו את ריכוז התאים ל-5 million cells per milliliter.
הניחו טיפה של 20 µL מתלי תאים במרכזו של כל באר. בתוך פלטת 24 באערים, דגרו את התאים באטמוספירה מבוקרת למשך 20 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד קלות לפני השטח של הבאר בשכבה אחת (monolayer) וליצור מגעים בין התאים. הניחו את הפלטה עם התאים על במה המיקרוסקופ.
מקמו את האלקטרודות בתחתית הבאר וחברו אותן למחולל הפולסים. כדי להשיג אלקטרו-היתוך (electro fusion) אופטימלי ולשמור על חיות התאים, יש להשתמש בפרמטרים מתאימים של פולסים חשמליים. פרמטרים אלו תלויים בסוג תרבית התאים ויש לקבוע אותם בניסויים מקדימים. הסירו את מצע התרבית ושטפו את התאים ב-1 mL של חוצץ פוטסיום פוספ antioxidant ISO omu, ולאחר מכן ב-350 µL של חוצץ פוטסיום פוספ antioxidant hypos Miller, כדי להשרות נפיחות של התאים.
השאירו את התאים בבופר היפראוסמולי למשך שתי דקות לפני הפעלת הפולסים החשמליים. יש להפעיל את הפולסים החשמליים כאשר התאים קרובים לנפח המקסימלי שלהם, כלומר לפני שהם מתחילים בתהליך של ויסות נפח.
ירידה בניסוי שלנו. הופעל רצף של שמונה פולסים מלבניים במשך 100 microseconds בתדירות של one hertz. לאחר הגשת הפולסים.
השאירו את התאים ללא הפרעה למשך 10 דקות לאחר 10 דקות. קבעו את נבגי הדיפוזיה באמצעות מיקרוסקופ פאזה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. רכשו שלוש תמונות, פאזה, פלואורסצנציה אדומה וירוקה, בחמישה שדות ראייה שנבחרו באופן אקראי.
בכל מקרה, ניצור תמונות תלת-ערוציות מכל שלשיית תמונות בתוכנת Image J כדי לשפר את האיכות הוויזואלית של התמונות לפני יישום שלבי עיבוד מקדמי על התמונות המקוריות, הכוללים הסרת רקע ושיפור ניגודיות עם מערכי פרמטרים ברירת מחדל. לבסוף, תמונות תלת-ערוציות מורכבות באמצעות תוסף RGB to gray של Image J. בתמונה כזו ניתן לראות את הציטופלזמה במצב מנוחה יחד עם ממברנות התאים.
כך ניתן לקבוע בקלות מספר מצומצם של תאים בתמונה בעלת שלושה ערוצים; ספרו את שלושת סוגי התאים: האדומים, הירוקים והפלואורסצנטיים הכפולים. קבעו את אחוז התאים הפלואורסצנטיים הכפולים על ידי חלוקת מספר התאים הפלואורסצנטיים הכפולים במספר כל התאים בכל תמונה. ניצול ההיתוך (Fusion yield) מוגדר לאחר מכן כאחוז התאים הפלואורסצנטיים הכפולים כשהוא מוכפל בשניים.
מאחר שמחצית מתאי התצפית אינם מזוהים כאשר תאים של אותו צבע נצפים.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים מיזוג חשמלי (electrofusion) יעיל של תאים in vitro באמצעות שיטת היצמדות (adherence) משופרת בשילוב עם אלקטרופורציה. התהליך כולל זיהוי של תאים ממוזגים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- טכניקות להיתוך תאים
- שיטות אלקטרופורציה
- יישומים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- אלקטרופיוזיה (Electrofusion) היא טכניקה המפעילה פולסים חשמליים כדי להקל על היתוך תאים.
- השיטה יכולה להגביר את היעילות של יצירת תאים היברידיים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת ויזואליזציה של תאים שהתאחו.
- הבנת היתוך תאים היא קריטית עבור יישומים ביולוגיים שונים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה מהימנה לאלקטרו-היתוך (electrofusion) של תאים.
- להמחיש ולכמת את יעילות היתוך התאים.
- לספק פרוטוקול שניתן לשחזר במעבדות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאי מלנומה של עכבר תורבתו והוכשרו להיתוך.
- צבעים פלואורסצנטיים שימשו לסימון התאים לפני ההיתוך.
- פולסים חשמליים הופעלו כדי להשרות היתוך תאים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה שימשה לניתוח תוצאות ההיתוך.
תוצאות עיקריות
- השגתם היתוך תאים מוצלח, כפי שהודגם באמצעות פלואורסצנציה.
- חושב אחוז התאים בעלי פלואורסצנציה כפולה כדי לקבוע את נצילות ההיתוך.
- זוהו פרמטרי דופק חשמלי אופטימליים לשמירה על חיוניות התאים.
- האיכות הוויזואלית של התמונות שופרה באמצעות טכניקות לעיבוד תמונה.
מסקנות
- שיטת ההצמדה המשופרת יעילה עבור אלקטרו-היתוך של תאים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא כלי בעל ערך להערכת יעילות ההיתוך.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה לסוגים שונים של תאים במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור הנהלה
אלקטרו-היתוך של תאים המדומיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מספק פלטפורמה לא-ויראלית ולא-כימית ליצירת תאי היבריד, התומכת במחקר ביו-פרמצבטי בשלבים מוקדמים. ויזואליזציה כמותית של אירועי היתוך מאפשרת הערכה איתנה של טכניקות למניפולציה של תאים, המשפיעה באופן ישיר על תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי בזרימות עבודה מבוססות תאים ומספקת מידע לקבלת החלטות בפורטפוליו המותאמות לסיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מנגנוני איחוי תאים הרלוונטיים לבדיקת השערות טיפוליות.
- תומך בתיקוף תפקודי של אסטרטגיות למניפולציה של תאים ליצירת תאים היברידיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים (de-risking) באמצעות כימות של יעילות ומספריות ההיתוך.
- מספק פלטיים מדידים לצורך מיון פורטפוליו (portfolio triage) וביסוס רמת הביטחון במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מבסס מערכות תאים שעברו תיקוף לצורך סריקה המשכית של פנוטיפים תלויי-היתוך.
- מספק כימות סטנדרטי וניתן לשחזור של תווארי ההיתוך באמצעות פלואורסצנציה כפולה.
- מאפשר התרחבות (scalability) של הבדיקה ושימוש חוזר בפלטפורמה להערכת תרכובות המכוונות לתהליכי היתוך של תאים.
- תומך בביצוע השוואה (benchmarking) מהימנה של פרוטוקולי היתוך על פני סוגי תאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם זרימות עבודה תרגומיות על ידי אפשור יצירת תאים היברידיים למודלים פרה-קליניים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קלני של טיפולים מבוססי תאים.
- מפחית עמימות מכניסטית באסטרטגיות למניפולציה של תאים לצורך פיתוח טיפולי.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של קונספטים טיפוליים המבוססים על היתוך תאים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לכימות וויזואליזציה חסונים של היתוך תאים, ובכך היא תומכת הן בתיקוף ראשוני והן במחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מדידה כמותית של תבואת החיבור תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים.
- סריקה: קריאות פלואורסצנציה כפולות מאפשרות פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור והשוואה לביצועים סטנדרטיים.
- אנליטיקה: כימות מבוסס תמונה מספק תוצאות אובייקטיביות וניתנות להשוואה לצורך הערכת תנאים.
- מחקר תרגומי: יצירת תאי היבריד תומכת במידול פרה-קליני ובתיאום סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת העבודה ניתנת להתאמה לסוגי תאים ותוכניות מחקר שונות, ובכך מגבירה את ערך הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי היתוך תאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של כימות ההיתוך ותמיכה בחזרתיות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית בתוכניות בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של אסטרטגיות טיפול מבוססות תאים בהתאם לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות.
- נדרשת גישה למחוללי פולסים, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים ותוכנה לעיבוד תמונות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סימון, דימוג וכמותיות.
- התאמה בין קווי תאים עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרי הפולס ותנאי הסימון.
- יעילות היתוך והחיוניות תלויות בקו התאים ויש לקבען באופן אמפירי.
