המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטעין ננו-ספירות (Nanospheres) על מיקרוטובוליים, הגולשים על פני שטח מצופה בחלבוני מנוע מסוג קינזין (kinesin). מטרה זו מושגת תחילה על ידי ציפוי פני השטח של תא זרימה מזכוכית בתמיסת קזאין. השלב השני של הפרוצדורה הוא ספיחה של חלבוני מנוע קינזין אל פני השטח של תא הזרימה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת המיקרוטובוליים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הוספת מולקולות strept haver, אשר ייקשרו למיקרוטובוליים, ולאחר מכן הוספת הננו-ספירות. הננו-ספירות נקשרות לפני השטח של תא הזרימה, שם הן עשויות להיסף על ידי המיקרוטובוליים.

בסופו של דבר, ניתן להבחין כיצד ננו-ספירות נלכדות על ידי מיקרוטובוליים ומועברות לאורך פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, אני אליין ג'ן סמית' מהמעבדה של ד"ר הנרי הס ומחלקת מדעי החומרים והנדסה באוניברסיטת פלורידה. היום נדגים לכם פרוטוקול לבדיקת ניידות הפוכה (inverted motility assay).

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור טעינה של מטען על מיקרוטובולים ותנועה של מעביבים מולקולריים. אז בואו נתחיל. לפני תחילת נוהל זה, הכינו טריים את כל תמיסות המלאי כפי שמתואר בחלק הכתוב של סרטון זה.

לאחר הכנת תמיסות המלאי, התחל בהכנת המיקרו-טובולין על ידי פיפטור של 25 µL מתמיסת הצמיחה לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.65 mL. לאחר מכן, הוסף 6.25 µL מתמיסת הצמיחה ל-20 µg של טובולין ביוטיניליזציוני ליאופיליז. ערבב את התמיסה ב-Vortex והנח אותה באמבט חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לצורך פולימריזציה. לאחר האינקובציה, דלל את התמיסה פי 100 בבופר Taxol וערבב בעדינות ב-Vortex.

תמיסה זו משמשת לייצוב המיקרוטובוליים. סמנו את התמיסה כ-MT 100 ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דילול של פי עשרה של MT 100 בבופר anti-fade וסמנו תמיסה זו כ-MT 1000.

לאחר מכן, הכינו את מנועי ה-Kinesin על ידי דילול של תמיסת ה-kinesin פי 20 בבאפר TP. סמנו את התמיסה כ-kinase in 20 ושמרו אותה על קרח. לבסוף, הכינו את תמיסות ה-streptavidin והננוספירות.

ראשית, הוסיפו streptavidin מסומן ב-Alexa Fluor 5 6 8 לריכוז של 100 nano molars ב-Antifa Buffer. סמנו את התמיסה כ-STV 100, לאחר מכן דללו nanospheres פי 5, 000 ב-Antifa Buffer וסמנו תערובת זו כ-NS 5, 000. אחסנו את שתי התמיסות על קרח.

לאחר הכנת התמיסות עבור בדיקת טעינת המטען, בנו תא זרימה באמצעות זכוכית כיסוי וזכוכית כיסוי דקה המופרדות על ידי סרט דבק דו-צדדי. ראשית, הדביקו שתי רצועות של סרט דבק דו-צדדי בקצוות של זכוכית הכיסוי, תוך השארת מרווח של כסנטימטר אחד בין הרצועות. לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי דקה מעל הסרט.

הפעל לחץ על ליתר הכיסוי באמצעות הקצה השטוח של פינצטה כדי ליצור איטום. תא הזרימה שהוקם הוא באורך של כשני סנטימטרים, ברוחב של סנטימטר אחד ובגובה של 100 מיקרון, ונפחו הוא כ-20 microliters. כדי להתחיל בהרכבת הבדיקה ההפוכה.

הנח את קצה הפ pipette בין לביד הכיסוי לבין הזכוכית. לאחר מכן, הזרק 0.5 mg/mL של תמיסת casein אל תוך תא הזרימה. ציפוי זה של תא הזרימה יאפשר ל-kinesin לשמור על תפקודו עם הספיגה.

המתינו חמש דקות עד שפתרון הקזאין יצפה את המשטח. לאחר מכן, ספחו Kinesin אל תא הזרימה על ידי הכנסת הפתרון; פתרונות מוכנסים לתאי הזרימה באמצעות הנחת קצה הפפיטה בין לביבת הזכוכית למשטח הזכוכית. לאחר מכן, מזריקים את הפתרון לתא הזרימה מצד אחד, בעודו נספג בו-זמנית מהצד השני.

בעזרת נייר סינון, המתינו חמש דקות לספיגת ה-kinase in. לאחר מכן, הכניסו את המיקרוטובוליים לתא הזרימה (flow cell) על ידי פיפטור של תמיסת MT 1000 אל תוך תא הזרימה. המתינו חמש דקות לשקיעת המיקרוטובוליים ולהיצמדותם למנועי ה-kinase in, בעקבות היצמדות המיקרוטובוליים למנועי ה-kinase in.

צפו את המיקרוטובוליים ב-strep TTR פלואורסצנטי על ידי הזרמת תמיסת STV 100 אל תוך תא הזרימה. המתינו חמש דקות כדי לאפשר למולקולות strep TTR להיקשר למיקרוטובוליים. שטפו את עודפי ה-strep TTR באמצעות שלוש שטיפות של 30 µL מתמיסת Antifa אל תוך תא הזרימה.

לבסוף, הכניסו את ננו-ספירות הפלואורסצאין מפוליסטירן הביוטיניליות על ידי פיפטינג של תמיסת ה-NS 5,000 אל תוך תא הזרימה. השטח סופח וסטטי. ננו-ספירות יתנגשו עם המיקרוטובוליים הנעים וייקשרו אליהם.

בניסוי זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנציה מסוג eclipse TE 2000 U המצויד בעדשת שמן 100x, ב-X site, בנורת 20 אחת ובמצלמת exon E-M-C-C-D. ראשית, יש להניח טיפה אחת של שמן טבילה על העדשה. לאחר מכן, התקן את תא הזרימה עלבמת המיקרוסקופ באמצעות קוביית המסננים trixy.

הביאו את המיקרוטובוליים למצב פוקוס, ולאחר מכן עברו לקוביית המסננים של fitzy כדי לצפות בננו-ספירות. כעת, פתחו את תוכנת ה-and or I exon והגדירו את מצב הרכישה (acquisition mode) לקינטי. השתמשו בזמן חשיפה של 0.5 שניות, באורך סדרה קינטית של 20 ובזמן מחזור קינטי של שש שניות.

העבירו את המיקרוסקופ מהעינית למצלמה והתחילו ברכישת תמונות. עבור ארבע התמונות הראשונות, השתמשו בקוביית trixi כדי לדמות את המיקרוטובוליים. עבור 12 התמונות הבאות, עברו לקוביית מסנן Fitz כדי לרכוש תמונות של הננוספירות.

לאחר מכן, חזרו לקוביית המסננים trixi. עבור ארבע התמונות האחרונות שנועדו להדמיית המיקרוטובולים, המיקרוטובולים נצפים באמצעות קוביית המסננים Trissy, כאשר קוביית המסננים מוחלפת ל-fite. כדי להדמיז כאן את הננו-ספירות, הננו-ספירות המובלות על ידי מיקרוטובולים מסומנות באמצעות החצים. לא כל הננו-ספירות נאספו על ידי המיקרוטובולים.

כעת מוצג מיקומם של הננו-ספירות לאחר 36 שניות, מה שחושף כי הננו-ספירות זזו. כאשר המיקרוטובוליים מצולמים שוב, ניכר כי גם הם נעו לרוחב שדה הראייה. תמונות אלו מדגימות כי הננו-ספירות הועתקו כתוצאה מהסעה של המיקרוטובוליים.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע את בדיקת הניידות ההפוכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחליף את קוביות המסנן בזמן רכישת התמונות, כדי שניתן יהיה לראות הן את המיקרוטובוליים והן את הננו-ספירות. זהו כל התהליך.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.