בידוד בתאי גזע רקמות השלד והשרירים Soft

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי גזע בוגרים מרקמות רכות של השרירים והשלד, כגון שריר שלד. דבר זה מושג תחילה על ידי נטילת ביופסיה של הרקמה הרכה, ביצוע דהברידמנט וקיצוץ של הרקמה לחתיכות קטנות. השלב השני של ההליך הוא עיכול אנזימטי של הרקמה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא בידוד התאי הגזע באמצעות שלבי pre plating חוזרים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא זיהוי התאי הגזע שבודדו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את ההתנהגויות המורפולוגיות והתאיות של התאים באמצעות אימונופלורסצנציה, מיקרוסקופיה ו/או ציטומטריה עם זרימה.

שלום, אני y Lee מהמעבדה לפתולוגיה מולקולרית במחלקה לכירורגיה אורתופדית באוניברסיטה של פיטסבורג. היום אראה לכם כיצד לבודד תאי גזע בוגרים מרקמות רכות של מערכת השלד, כגון שריר שלד. שלום, אני ד"ר ג'וני וורד.

אני פרופסור בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג, במחלקה לכירוגיה אורתופדית. אני עובד, כפי שאתם יודעים, בשיתוף פעולה הדוק עם ד"ר Young Lee על הפרוצדורות הללו לבידוד סוגים שונים של תאי גזע משריר שלד ומרקמות אחרות, כגון רסס. אנו משתמשים בפרוצדורות הללו במעבדה שלנו כדי לבודד תאי גזע עבור מחקרי בסיס על יישומים של רפואה תרגומית.

כעת נתחיל בלימוד. הרקמות מהן ניתן לבודד תאי גזע יכלולו גידים ושרירים שלדון שנקצרו מהטיביה או משרירי הסולאוס (Soleus) של הגפה האחורית של עכברים מסוג פרא (wild type). לאחר הסרת שאריות עור ועצם, העבירו את הרקמות לצלחית המכילה HBSS קר, בתוספת 5% FBS.

בשלב הבא, הניחו את הרקמה בנפרד על צלחות מצופות קולגן המכילות HBSS קר. נשתמש ברקמות שריר שלד כדי להדגים את הפרוצדורות הבסיסיות לפירוק ועיכול של רקמה. השתמשו במספרי מיקרו ו/או להבי סקאלפל כדי לקצוץ את רקמות השלד לעיסה גסה לצורך עיכול אנזימטי של הרקמות ב-pH מתאים.

התחילו בהעברה של תרחיפי הרקמה של ה-MIT לשפופרות נפרדות של 15 מיליליטר וסובבו בצנטריפוגה במהירות של כ-3,500 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסירו את שטיפת ה-SANE על ידי Resus suspending ב-HBSS וחזרו על הסבב בצנטריפוגה. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernat), עיכלו את התרחיפים על ידי הוספה של 10 מיליליטר של 0.2%collagenase שחומם מראש.

דגמו את סוג 11 להדגרה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, תוך ניעור ידני של המבחנות מדי 10 דקות. עם סיום ההדגרה של 60 דקות, בצעו צנטריפוגה ולאחר מכן השעיו שוב את התעלקים ב-10 milliliters של תמיסת DYS space. הדגרו למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, תוך ניעור ידני מדי 10 דקות. לאחר סיום ההדגרה של 45 דקות, בצעו צנטריפוגה והשעיו שוב את התעלקים ב-10 milliliters של תמיסת 0.2%trips ב-HBSS.

בדרך כלל אנו מדגירים למשך 15 עד 20 דקות ב-37 °C תוך הפכי של המבחנות מדי 10 דקות, עד לסיום הדגירה. כאשר משוחררים מספיק תאים בודדים מהרקמות, כפי שמוצג כאן, סנטריפוגו את התאים שהתקבלו ותלהו מחדש את משקע התאים ב-5 mL של מצע פרוליפרציה (PM). פלקו את תמיס התאים על ידי העברת התוצריים דרך סדרה של מחטים פעמיים דרך מחט בגודל 18 gauge, לאחר מכן פעם אחת דרך מחט בגודל 23 gauge ולבסוף פעם אחת דרך מחט בגודל 27 gauge.

לבסוף, העבירו את תמצית התאים דרך מסננת תאים של 70 micron כדי להתחיל בטכניקת ה-prepl. סנטריפוגו את תמצית התאים שהוכנה כעת ושספנדו את המשקעים במדיום פרוליפרציה. העבירו חמישה milliliters של תערובת התאים לבקבוק T 25 מצופה בקולגן וסמנו אותו כ-PP1; דגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide למשך שעתיים.

לאחר שעתיים, העבר את התאים שאינם נצמדים לבקבוק T 25 חדש מצופה בקולגן וסמן אותו כ-PP two. הוסף 5 mL של PM לבקבוק ה-T 25 הקודם המסומן כ-PP one.

החזירו את שני הבקבוקים למדגרה למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, העבירו תאים שאינם נצמדים מהבקבוק PP two לבקבוק T 25 חדש מצופה ב-collagen ENC וסמנו אותו כ-PP three. הוסיפו חמישה מיליליטרים של מצע פרוליפרציה לבקבוק המסומן כ-PP two.

החזירו את הבקבוקים לאינקובטור. חזרו על הפעולה כל 24 שעות עד לאוכלוסייה PP six. כך נוצרת אוכלוסיית תאי הגזע.

מספר התאים המבודדים של PP six הוא קטן מאוד ויש לתחזק אותם במצע תרביית פרוליפרציה עשיר ב-FBS. מצע זה הוחלף מדי יום. עם זאת, מרבית התאים בתרבית ה-PP six ימותו במהלך השבועיים הבאים של התרבית.

אוכלוסיית PP six בריאה וגדולה נוצרת בדרך כלל לאחר שבוע עד שבועיים נוספים של הרחבה. תחזק גם את כל שאר קבוצות התאים התלויים, אפשר להם להתרבות ובחן אותם באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ הפוך. התאים הנצמדים הראשונים שנדבקים לבקבוקי ה-PP one וה-PP two הם לרוב תאים פיברוטיים.

תאים הנ adherent לבקריות מצופות קולגן לאחר פרק זמן ממושך של 48 עד 96 שעות. PP3 ו-PP4 הם בעיקר מיובלסטים. בעוד שתאי לוויין של השריר נראים לרוב בעיקר ב-PP5, תאי prepl מאוחרים יותר, 96 שעות או מאוחר יותר (PP6), נחשבים לתאי גזע בוגרים ונראים קטנים, עגולים ושקופים.

בתחילת בידודם, ניתן לאפיין אותם עוד יותר באמצעות אימונוהיסטוכימיה לבדיקת הביטוי של סמני תאי גזע, כגון stem cell, antigen one ו-CDC 34. הרגע הצגנו כיצד לבודד תאי גזע מתוך סמנתר של עכבר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על סטריליות לאורך כל השלבים.

לאחר בידוד תאי הגזע, יש לוודא שאת התאים הללו מתרבים בצפיפות נמוכה כדי לשמר את מאפייני תאי הגזע שלהם. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסיונכם, ואני מאחל לכם הצלחה בשימוש בשיטה זו בניסוי שלכם.

תודה.