האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה
1 ביוני 2010
T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T לימפוציטים במבחנה.
נדידה של לימפוציטים מסוג T מתרחשת במהלך הגירה לאיברים לימפואידיים, יציאה מכלי הדם וכניסה לרקמות פריפריאליות. תהליך זה כולל אינטראקציה דביקה של פני השטח של תאי ה-T עם תאים אחרים. כדי לבחון תופעה זו in vitro, מבודדים לימפוציטים מסוג T אנושיים, מגדלים אותם ומניחים אותם על פלטות לתרבית רקמה המצופות בחלבון דביק.
ICAM one וכימוקין SDF one. לאחר מכן ניתן להשיג ולנתח תמונות של נדידת תאי T lymphocyte. שלום, אני קרייג להפורט מהמעבדה של מינסו קים במרכז לביולוגיה ואימונולוגיה של חיסונים באוניברסיטת רוצ'סטר.
היום נדגים לכם פרוצדורה לבידוד ובישול של לימפוציטים T אנושיים, ואת ניתוח נדידתם in vitro. אנו משתמשים במבחן זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידם של האינטגרינים ואת נדידת תאי T. האינטגרין העיקרי בתאי T הוא lymphocyte function associated antigen one או LFA one.
הליגנדים הספציפיים עבור LFA one הם ה-icas, כגון ICAM one. בנוסף, נדרש אות קין (kin signal) עבור נדידת תאי T כדי לספק הן אות כיווניות והן כדי להפעיל אינטגרינים. במערך הבדיקה שלנו, אנו משתמשים ב-ICAM one אנושי וב-CX CL 12 או SDF one כתשתיות לנדידת תאי T.
אם כן, בואו נתחיל. לאחר קבלת דם אנושי מתורם בריא, יש להמתין עד שהדם יתקרר לטמפרטורת החדר. תהליך זה אורך כ-30 דקות.
לאחר קירור הדם, העבירו בזהירות באמצעות פיפט שלושה מיליליטרים של מצע גרדיאנט צפיפות פולימורפי בטמפרטורת החדר לתוך מבחנה פוליסטירן בעלת תחתית עגולה בנפח שמונה מיליליטרים. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות שלושה מיליליטרים של דם מלא מעל המצע. חשוב להימנע מכל ערבוב של השכבות.
הניחו את המבחנות בצנטריפוגה וסובבו אותן ב-500 G למשך 45 דקות. לאחר הצנטריפוגה, בטמפרטורת החדר, תבודדו התאים המונונוקליאריים של דם פריפריאלי (PBMCs) מרכיבי הדם האחרים. שכבת ה-PBMC מופיעה כפס העכור הראשון מהחלק העליון.
בתנאי סטריליות, הסיר בזהירות והשלך את השכבה העליונה השקופה בצבע צהוב. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפקה P 1000 כדי להעביר את שכבת ה-PBMC למבחנה קונית חדשה. שטוף את ה-PBMC פעמיים עם PBS על ידי סבב של התאים בצנטריפוגה ב-500 G למשך חמש דקות.
בכל פעם, הנוזל העליון (supernatant) יהיה עכור במידה רבה לאחר כל שטיפה. השעו שוב את התאים ב-20 milliliters של מצע RPMI 1640 המכיל 10%FBS, 1%penicillin streptomycin, ואחד microgram per milliliter של Phyto hemagglutinin או PHA. דגירה בנוכחות PHA משרה הפעלה והתרחבות של לימפוציטים מסוג T.
העבר את ה-pbmc לבקבוק תרבית T 75 באמצעות פיפטה. לאחר מכן, דגור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide למשך 1 עד 24 שעות. שלב זה מאפשר הפרדה של מונוציטים, אשר ייצמדו למשטח הבקבוק, מהלימפוציטים שנותרו בסספנסיה.
בעקבות הדגירה, הסירו בזהירות את כל המצע המכיל בעיקר לימפוציטים והעבירו אותו למבחנה קונית של 15 מיליליטר. סבבו במסננת (צנטריפוגה) ב-500 G למשך חמש דקות. השעיו את משקע התאים ב-RPMI 1640 והעבירו את התאים לבקבוק T 75 חדש המכיל 25 מיליליטר של RPMI 1640 עם FBS, פניצילין, סטרפטומייצין ו-PHA, והדגירו ב-37 degrees Celsius.
לאחר 24 שעות של גידול, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 15 עד 20 milliliters של מצע טרי ולהעביר לבקבוק T 1 75 גדול יותר. המשיכו בדגירה למשך שלושה או שניים ימים. אם הדגירה הראשונית של PBMC הייתה למשך הלילה ולאחר שלושה ימים, השתמשו בפיפט להוצאת המצע, שיכיל לימפוציטים תלויים, והעבירו אותו לפרוקת צנטריפוגה של 50 milliliter, צנטריפוגה במהירות של 500 G למשך חמש דקות.
ריס אספה את משקע התאים והעבירה אותם לבקבוק T 75 חדש המכיל 25 milliliters של RPMI 1640 עם FBS, פניצילין, סטיפტომיצין ו-human IL 2 או IL 15, ולאחר מכן הניחה את התאים באינקובטור. אם מתחילים עם בקבוק T 75, יהיה צורך להרחיב את התרבית ולהעבירה לבקבוק T 175.
לאחר יום עד יומיים, גדלו את הלימפוציטים למשך ארבעה עד שבעה ימים בסך הכל. יום אחד לפני בדיגת הנדידה, צפו את תחתית צלחת זכוכית בעובי 0.17 מילימטר ב-20 micrograms per milliliter של חלבון A או G ב-PBS, והדגרו למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את הצלחת היטב ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו לצלחת תמיסת ICAM one FC ו-human SDF1 ב-PBS.
דגרו במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר כדי לקבע את המולקולות. קבעו את צפיפות התאים התרביתיים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, שטפו את הלימפוציטים פעמיים ב-PBS והשביו אותם למחיליל של מיליליטר אחד של תווך L 15 המכיל D glucose. לאחר הדגירה, שטפו היטב את הצלחת המצופה ב-ICAM one FC וב-SDF one באמצעות PBS. העבירו את תאי ה-T lymphocytes במיליליטר אחד של תווך אל הצלחת; יש להשתמש בכ-2 עד 5 פעמים 10⁵ תאים לצלחת כדי להגיע לצפיפות תאים המתאימה לניתוח נדידה.
כדי לקבל תמונות של נדידת תאים, הניחו את הצלחת על במת המיקרוסקופ בסביבה עם בקרת טמפרטורה, כגון תא מחומם ב-37 °C. פתחו את תוכנת NIS elements בתפריט הגדרות התמונה. בחרו ב-two by two binning כמצב עבור דימות חי (live imaging) ועבור לכידת תמונות.
עברו לתפריט היישומים ובחרו ב-define, run, experiment. בחרו את פרק הזמן בין התמונות ואת הזמן הכולל. עבור רצף לכידת התמונות, לחצו על כפתור ה-run כדי להתחיל ברכישת התמונות בעקבות הרכישה.
ניתן לכמת פרמטרי נדידה כגון מהירות, אורך מסלול והעתקה באמצעות חבילת תוכנה כגון Image J Auto Quant או veloc. כדי להפיק גרף רשת עכביש (spider web plot), אספו את קואורדינ efekטות ה-XY עבור כל תא ונקודת זמן, והשליכו אותם על גרף עם נקודת התחלה משותפת לכל תא בראשית הצירים. תאי ה-T לומפocytes המוצגים כאן גודלו על ICAM ו-SDF one, וצולמו מדי 10 שניות למשך 30 דקות.
סרט זה מציג נדידה אקראית של T lymphocytes במהירות של כ-15 microns per minute באמצעות קואורדינטות XYT עבור כל תא. 15 תאים נבחרו באופן אקראי ושורטטו עם נקודת התחלה משותפת בראשית הצירים. השוואת גרפי קורי עכביש (spiderweb plots) מספקת תיאור חזותי מהיר של הבדלים בנידידה בין תנאים ניסיוניים שונים.
גרפים של נדידת תאי T תחת תנאי בקרה מוצגים משמאל, בעוד שגרפים של נדידת תאי T בנוכחות נוגדן חוסם לליגנד anti LFA one מוצגים מימין. נתונים אלו מדגימים כי תאי T משתמשים באינטגרין LFA one כדי לנדוד על תשת ICAM one. הרגע הצגנו לכם כיצד לבצע בדיקת נדידה באמצעות תאי T אנושיים שהוצאו מתרבית במהלך הפרוצדורה.
חשוב לזכור להוסיף מספר מתאים של תאים לצלחת המצופה ב-ICAM 1, כדי שמעקב התאים וניתוח הנדידה יהיו פשוטים יותר. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
נדידת תאי T לימפוקיטים היא קריטית להגעתם לאיברים לימפואידיים ולכניסתם לרקמות פריפריאליות. מאמר זה מתאר פרוטוקול לניתוח נדידה של T לימפוקיטים in vitro.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- טכניקות in vitro
רקע
- לימפוציטים מסוג T ממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית.
- נדידתם כרוכה באינטראקציות היצמדות עם תאים אחרים.
- הבנת תהליך זה עשויה לספק תובנות לגבי התפקוד החיסוני.
- ניתוח במבחנה (In vitro) מאפשר מחקר מבוקר של אינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- ניתוח נדידה של לימפוציטים מסוג T תחת תנאים מבוקרים.
- בחינת ההשפעות של חלבונים דביקים (adhesive proteins) על הנדידה.
- אספקת פרוטוקול מפורט עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ותרבית של לימפוציטים T אנושיים.
- שימוש בצלחות תרבית רקמה מצופות בחלבונים דביקים.
- יישום של כימוקינים לעידוד נדידה.
- רכישת תמונות וניתוח תנועת לימפוציטים T.
תוצאות עיקריות
- בידוד ותרבית מוצלחים של T lymphocytes.
- הדגמה של נדידה בתגובה לחלבוני הדבקה.
- ראיות חזותיות לתנועת T lymphocytes שתועדו באמצעות דימות.
- תובנות לגבי מנגנוני הנדידה של T lymphocytes.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר נדידה של T lymphocytes.
- הממצאים תורמים להבנת התנהגות תאי מערכת החיסון.
- מחקר זה יכול להנחות מחקרים עתידיים על תגובות חיסוניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת נדידת תאי T היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות אימונו-תרפיוטיות במחלות אוטואימוניות ודלקתיות. בדיקה זו in vitro מאפשרת הערכה מכניסטית של ניידות תאים המתווכת על ידי אינטגרינים, ובכך תומכת בתיקוף המטרה ובזיהוי מולקולות מובילות (lead identification). מדדי נדידה כמותיים מספקים ביטחון חיזוי עבור אסטרטגיות של מודולציה של מסלולים ביולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע לתפקוד האינטגרין LFA-1 בתנועת לוקוציטים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי מדידת עיכוב נדידה באמצעות חסימת אינטגרין או מעכבי אקטומיאוזין.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור מעורבות המטרה להפחתה במהירות הנדידה (~15 μm/min בתנאי ביקורת).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות תאי T מאושדות המצופות ב-ICAM-1 וב-SDF-1 לצורך סריקת תרכובות הניתנת לשחזור.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי ההיצמדות והגירוי באמצעות כימוקינים כדי לאפשר קריאות כמותיות המבוססות על דימוי.
- יכולת הרחבה: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה לצורך ניתוח תגובה-מינון של פרמטרים של נדידה לאורך תנאים ניסיוניים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מדמה נדידה של T lymphocytes אנושיים הרלוונטית לגיוס לוקוציטים בדלקת ובמחלות אוטואימוניות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהירה את דרישות ההפעלה הסבקו-טמפורלית של אינטגרינים ואת נסיגת העורופוד (uropod) לצורך ניידות מתמשכת.
- המשכיות פרה-קלינית: מקשרת בין פנוטיפים של נדידה in vitro לתהליכי homing וחדירה לרקמות in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), ומספקת תוצאות פנוטיפיות מבוססות-נדידה המנחות החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מצבי הפעלה של אינטגרינים ובבקרת השלד התאי בניידות של תאי T.
- סריקה: מספק אוכלוסיות סטנדרטיות של לימפוציטים T המוכנות לבדיקה, עם תגובתיות מוגדרת להיצמדות ולכימוטקסיס.
- אנליטיקה: מאפשר כימות של מהירות, אורך מסלול והעתקה באמצעות ניתוח תמונות לצורך השוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין עיכוב נדידה in vitro להשפעות פוטנציאליות על תעבורת לוקוציטים במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית להערכת תרכובות אימונומודולטוריות לאורך מספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק הפחתת סיכונים מכניסטית עבור מטרות אינטגרין ושלד התא באמצעות פנוטיפינג ישיר של נדידה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד, תרבית וציפוי של תשתית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתאם בין מודולציה של המטרה לבין יכולת נדידה מופחתת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מועדכן-סיכונים של מועמדים בהתבסס על עיכוב פונקציונלי של ניידות לוקוציטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד לימפוציטים ראשוניים מבני אדם ובטכניקות של תרבית תאים סטרילית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופיה תחת בקרת טמפרטורה ותוכנה לניתוח תמונות (למשל, ImageJ, Veloc).
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות התאים (2–5 × 10⁵ cells/dish) וציפוי חלבונים (ICAM-1, SDF-1) למעקב עקבי אחר נדידה.
- דורש תיקוף של תנאים מעכבים (למשל, נוגדני anti-LFA-1, מעכבי actomyosin) כדי לאשש את ספציפיות הבדיקה.
- מוגבל לניתוח נדידה דו-ממדית (2D); ייתכן שלא ישחזר באופן מלא את הדינמיקה של יציאה מרקמות תלת-ממדיות (3D extravasation).
