יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis
16 בספטמבר 2010
הצפרדע Xenopus laevis מספק מודל אטרקטיבי חלופי שאינו לחקר יונקים את היכולת של חלבון הלם חום כגון gp96 לקדם אנטיגן ספציפי CD8 T התגובות התא. אנו מציגים שיטות מחקר In vivo סיוע של המצגת הנגדית של אנטיגנים סרטניים בעור על ידי gp96.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את היכולת השמרנית מבחינה אבולוציונית של חלבון השוק התרמי GP96 לעודד תגובות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בקרפד Xenopus laevis. זאת מושג תחילה על ידי איסוף לוקוציטים פריטוניאליים באמצעות שטיפה פריטוניאלית. השלב השני של ההליך הוא חשיפה (pulsing) של הלוקוציטים הפריטוניאליים ל-GP96 שמקורו בגידול, המשמש כצ'פרון לאנטיגנים מינוריים ולאנטיגני גידול, לאחר דגירה ושטיפות.
הלוקוציטים הפריטוניאליים מועברים באופן אדופטיבי באמצעות הזרקה אינטרה-פריטוניאלית לצפרדעים נאיביות, במטרה לחסן צפרדעים אלו נגד גידולים או נגד אנטיגנים של תאירי-התאמה משניים (minor histocompatibility antigens). השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע השתקת עור או חשיפה לגידול בצפרדעים המחוסנות, וניטור הופעת דחיית השתקת העור או הופעת הגידול. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא השגת דם פריפריאלי לצורך אפיון תאי ה-T המעורבים בתגובות דחיית העור והתגובות האנטי-גידוליים.
בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות האצה משמעותית של דחיית השתלת עור, וכן עיכוב בהופעת גידולים בקרב צפרדעים שעברו priming של GP 96, באמצעות בדיקות השתלת העור ובדיקות חשיפה לגידול, בהתאמה. שלום, אני כריסטינה קוסקה מהמעבדה של ד"ר ז'אק רובר במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר. אני טניה קרוז, גם אני מהמעבדה של ד"ר ריברס.
היום נדגים לכם פרוצדורה להטרמה של צפרדעים שיבוטיות באמצעות העברה אדופטיבית של לוקוציטים פריטוניאליים, ולאחריה בדיקות של השתלת עור והשתלת גידולים. בנוסף, נראה לכם כיצד להוציא דם פריפריאלי מבעלי חיים אלו. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את יכולתו של חלבון הלם חום GP 96 לעודד תאי CDAT ספציפיים לאנטיגן ב-Xenopus, וכן כדי לחקור את סוגי התאים המעורבים.
בסדר, בואו נתחיל. הצפרדעים ששימשו בניסויים שלנו הן שיבוטים איזוגנטיים מהמושבה שלנו באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי לעורר תאי לוקוציטים פריטוניאליים (pls) לצורך איסוף, השתמשו במחט 25 gauge באורך 5/8 כדי להזריק לצפרדע המורדמת באופן אינטraperיטוני תכשיר של e coli שהורג בחום. שלושה ימים לאחר ההזרקה, ה-pls נאספים באמצעות שטיפה אינטraperיטונית.
כדי להתחיל בהליך זה, חטאו את בטנו של הצפרדע המורדמת עם כמות קטנה של 70% ethanol. לאחר מכן, השתמשו במחט 18 gauge בגודל 1.5 כדי להזריק חמישה מיליליטרים של תמיסת סליין פוספט (phosphate buffered saline) סטרילית לדו-מינתיים, או PBS שחומם מראש לטמפרטורת החדר, אל תוך החלל הפריטונאלי. הוציאו את המחול והסעו בעדינות את הצפרדע במשך דקה כדי להבטיח שהבופר המוזרק יתערבב עם הנוזלים בחלל הגוף.
בשלב הבא, הכניסו מחט חדשה במידה 18 ובאורך 1.5 ללא מזרק אל תוך בטנו של הצפרדע. תוך הימנעות מכלי דם, אספו את הנוזל הפריטוניאלי שיטפטף מאחורי המחט אל תוך מבחנה קונית נקייה בנפח 50 milliliter. ודאו שאתם שואבים כמה שיותר מהנפח שהוזרק בתחילה לאחר ש-pls נאספו.
הניחו את הצפרדע במיכל עם מים רדודים עד להתעוררותה, ואז ניתן להחזירה לכלוב. לאחר איסוף ה-pls, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסירו את ה-sup, natant ובצעו resus. השהו את ה-pls ב-A PBS קר.
העבירו את ה-PLS התלוים לתוך מבחנה פלסטיקית (microcentrifuge tube) בנפח 1.5 מיליליטר. כדי לדחוף (pulse) את ה-PLS עם GP 96, הוסיפו את הכמות המתאימה של GP 96 ל-PLS וערבבו באמצעות פיפטור. הדגירו על קרח למשך שעה אחת. לאחר שעה אחת.
סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 14, 000 RPM למשך דקה אחת. כדי להסיר GP 96 שאינו קשור, הסירו את העלייה (supernatant). הוסיפו A PBS קר וסבבו מחדש (resuspend).
השעה שוב את ה-PLS בצנטריפוגה. שטוף את ה-S ב-A-P-B-S-A קר סך הכל שלוש פעמים כדי להבטיח שלא נשאר G 96 שאריתי לאחר השטיפה הסופית. השעה מחדש את ה-pls הפועמים בריכוז של 5×10⁵ pls ל-300 µL של PBS לצורך העברה אדופטיבית של pls למקבלי LG six נאיביים.
הזריק באופן תוך-פעריטוני 300 µL של pulsed pls לכל חיה. יש להכין את הצפרדעים לפחות שלושה ימים לפני ניסויי השתלת העור או חשיפה לגידול, שיוצגו בהמשך. העור להשתלה מופק מצפרדע תורמת מסוג LG 15 תחת הרדמה.
השתמשו במספריים כדי לחתוך ולהסיר פיסה קטנה של עור בטני, זהו עור הבטן הנראה כסוף. בשל נוכחותם של ARI ארבעה תאים פיגמנטריים בעת טיפול בשתל. חיוני לצמצם ככל האפשר את המניפולציה של הרקמה, מכיוון שדבר זה יגרום לנזק לשתל.
החזיקו את העור בעדינות רבה בעזרת פינצטה והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה PBS קר. השאירו את צלחת הפטרי על קרח. הניחו את העור על זכוכית כיסוי נקייה והשתמשו בתער כדי לחתוך שתלים בודדים לחתיכות של 5 mm על 5 mm.
שמרו את השברים ב-PBS על קרח לצורך השתלת העור בקרפדה המקבלת LG six. ראשית, בצעו חתך קטן בעור הגבי של המקבל המורדם. לאחר מכן, הכניסו את השתל בגודל 5 מילימטר על 5 מילימטר תחת העור, כאשר הצד הכסוף פונה כלפי מעלה.
יש להקפיד לסמן את סימני המספריים והפינצטה על הש transplanted grafts, מכיוון שסימנים אלה אינם נחשבים כדחייה של הש transplanted graft. כאשר שלב הניקוד מתחיל 24 שעות לאחר מכן, יש להסיר חלק מעור המארח המכסה את ה-graft. השתמשו במספריים כדי לגזור "חלון" מסביב ל-graft, כך שניתן יהיה לראות את ה-graft באופן חופשי.
הקפידו לא לגעת בעור התור ולא לגרום לדימום. התחילו ברישום השתל מיד על ידי ביצוע שרטוט. השתלת עור.
הדחייה נקבעת על פי אחוז ההרס של ה-aridol על העור המושתר. יש לבדוק את השטרset בכל יומיים עד שלושה ימים תחת מיקרוסקופ סטריאו. הכינו תאי גידול להשתלה על ידי תליה (resus), כאשר הם מושעים במצע גידול לתאים סרטניים בצפיפות של 5x10⁵ תאים ל-300 µL.
השקיעו את התאים באמצעות הזרקה תת-עורית בצד אחד של הגב של בעל החיים. לכל צפרדע מוזרקים 5×10⁵ תאים בנפח של 300 µL. צמיחת הגידול תחל בתוך שבועיים עד שלושה שבועות לאחר השבאת הגידול.
שימו לב למראה הראשוני של הגידול. השתמשו בקליפרים למדידת ממדי הגידול ורשמו את נפחו מדי יומיים עד שלושה ימים לפני איסוף לוקוציטים מדם הצפרדע. הכינו מחטים מזכוכית על ידי משיכת pasta peppes מעל להבה.
לאחר השחזת הקצה העדין של הפיפטה תחת מיקרוסקופ סטריאו, חברו את הפיפטה לצינור שאיפה מפלסטיק. כדי להתחיל באיסוף הדם, גזרו את העור מעל הרגל האחורית של הצפרדע המורדמת כדי לחשוף את וריד הטרסוס הגבי (dorsal tarsus vein). מלאו את מחט הזכוכית ב-1 עד 2 מיליליטר של תמיסת PBS קרה מאוד עם הפרין.
לאחר מכן, הכניסו את מחט הזכוכית לווריד והתחילו לאסוף דם על ידי שאיבה איטית באמצעות הפה. ניתן להשיג בין 1 ל-2 מיליליטר של דם מצפרדע ממוצעת בגודלה. אין צורך לתפור את החתך הקטן ברגל הצפרדע.
הפצע יחלים בתוך שבוע. כאן מוצגות תוצאות של ניתוח במיקרוסקופ סטריאוסקופי של דחיית השתלת עור 12 ימים לאחר ההשתלה. צפרדע LG six משובטת שקיבלה השתלת עור מתורם LG six בעל MHC זהה לא הראתה דחייה.
הכוכבית מציינת את פינצטת הסימון שאינה מעידה על דחייה. לעומת זאת, צפרדע משובטת מסוג LG six שקיבלה השתקה של עור מתורם לא-קרוב גנטית (outbred) עם MHC שונה, מראה דחייה של 80%. בשתי התמונות, החיצים מצביעים על תאי פיגמנט כסופים (silvery iridophores) המסמנים רקמת השתקה בריאה שאינה נדחית.
בניסוי הבא, הזרקו ל-LG 15 פולסים של PBS כביקורת שלילית, או של GP 96 רקומביננטי שנוקה מתרבית e coli, או של GP 96 שנוקה מתאי רקמת גידול מסוג 15 zero. לאחר מכן, ביצעו העברה אדופטיבית של תאים אלו לנמעני LG 15 בוגרים, ושלושה ימים לאחר מכן הושתלו תאי גידול 15 zero חיים באמצעות הזרקה תת-עורית. נעקב אחרי הגידולים שהופיעו לראשונה מספר ימים לאחר האתגר, וגודל הגידול נמדד באופן תקופתי. בגרפים אלו, כל עקומה מייצגת את קינטיקת גדילת הגידול בצאבענק אחד. התוצאות מראות כי בבעלי חיים שקיבלו טיפול מקדים של 0.5 או 1 µg של GP 96, הופעת הגידול הייתה מושהית באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות הביקורת. לכן, GP 96 מקדם הצגה צולבת של אנטיגנים של גידולים ב-Xenopus.
כך הדגמנו כיצד לבחון את היכולת של GP 96 להציג הן אנטיגנים מינוריים והן אנטיגנים של גידולים בקרפדה *Xenopus laevis* באמצעות השתקת עור ובדיקות של השתלת גידולים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מאיסוף שטיפת פריטונאום אם נגרם נזק לכלי דם, מכיוון שמרבית התאים במקרה זה הם תאי דם אדומים ולא מקרופאגים. כמו כן, חשוב להימנע מלחיצת רקמה עם הפינצטה בעת מניפולציה של השתקת העור כדי למנוע נזק.
זהו זה. תודה על השטיפה ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידה של חלבון הלם החום gp96 בקידום תגובות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בקרפדה מהמין Xenopus laevis. השיטות המוצגות מקלות על חקירת הצגה צולבת (cross-presentation) של אנטיגנים מהעור ומגידולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה השוואית
רקע
- חלבון הלם חום (Heat shock proteins) הוא חיוני לתגובות חיסוניות.
- Xenopus laevis משמש כאורגניזם מודל שאינו יונקי.
- הבנת תגובות תאי T יכולה לספק מידע רב לאימונותרפיה של סרטן.
- הצגה צולבת (Cross-presentation) היא מפתח להפעלה יעילה של תאי T.
מטרת המחקר
- לבחון את השימור האבולוציוני של gp96.
- להעריך את תפקידו בהפעלה של תאי CD8 T.
- להעריך תגובות חיסוניות לאנטיגנים של גידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף לוקוציטים פריטוניאליים באמצעות שטיפה פריטוניאלית.
- חשיפה פולסית של הלוקוציטים ל-gp96 המופק מגידולי סרטן.
- העברה אדופטיבית של לוקוציטים לצפרדעים נאיביות.
- ניטור דחיית הש transplanted skin graft או הופעת גידולים.
תוצאות עיקריות
- הצלחה בחסון ראשוני (priming) של צפרדעים כנגד אנטיגנים של גידולים.
- תצפית על דחייה של השתקת עור בצפרדעים שעברו חסון ראשוני.
- אפיון של תאי T המעורבים בתגובות חיסוניות.
- תובנות לגבי תפקידו של gp96 בהפעלה של תאי T.
מסקנות
- gp96 מקדם ביעילות תגובות של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- Xenopus laevis הוא מודל בעל ערך למחקרים אימונולוגיים.
- הממצאים עשויים לשפר את ההבנה של אימונותרפיה לסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה של Xenopus laevis מספק מערכת שאינה יונקית להערכת הצגת אנטיגן המתווכת על ידי gp96 והגברה (priming) של תאי T, ובכך תומך בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של פיתוח אימונותרפיה. הבדיקה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של gp96 כסייען (adjuvant) על ידי הדגמת יכולתו להגביר תגובות של תאי CD8 T נגד אנטיגנים של גידולים in vivo. התוצאות מספקות בסיס להחלטות go/no-go על ידי קישור הפעילות של הסייען לתוצאות חיסוניות מדידות, כגון השהיה בהופעת הגידול ודחייה מואצת של השתלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את ההשערה הטיפולית ש-gp96 מקדם הצגה צולבת (cross-presentation) של אנטיגנים המלווים על ידי צ'פרונים כדי לעורר תגובות של תאי CD8 T.
- ערך תפעולי: משתמש בהעברה מאסטיבית (adoptive transfer) של לוקוציטים פריטוניאליים כדי לתקף באופן פונקציונלי את הפעילות של gp96 במערכת חיה.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כך שמראה כי gp96 יכול להתגבר על בריחה חיסונית של גידולים המתרחשת באמצעות דה-רגולציה של MHC class Ia.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות באמצעות דירוג דחייה של השתלת עור וקינטיקה של צמיחת גידול לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי priming ו-challenge הניתנים לשחזור תוך שימוש בלבקוציטים פריטוניאליים כ-APCs.
- ערך מדעי: מאפשר השוואה מקבילה של מקורות gp96 (רקומביננטי לעומת נגזר גידול) לצורך זיהוי המועמד המוביל.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- ערך מדעי: תואם לרלוונטיות למחלה על ידי מידול תגובות לאנטיגן של גידול בהקשרים של חסר ב-MHC class Ia.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה רציפה מאיסוף לוקוציטים ועד לאפיון התאים האפקטורים באמצעות ניתוח דם פריפריאלי.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי על ידי הקשר בין מינון של gp96 לבין הופעה מאוחרת של הגידול.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת הערכה איטרטיבית של חומרים אימונומודולטוריים.
- ביולוגיה של גילוי: בחינת היפותזות מכניסטיות לגבי הצגה צולבת של אנטיגנים והפעלת תאי T באמצעות מדדים in vivo.
- סריקה: אספקת תוצאות כמותיות וסטנדרטיות (% דחיית השתלה, זמן השהייה של הגידול) להשוואת מועמדים לאדג'ובנטים.
- אנליטיקה: מאפשרת ביצוע ציטומטריה של זרימה ובדיקות פרוליפרציה של לוקוציטים בדם פריפריאלי לאפיון אוכלוסיות אפקטוריות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול תרחישים של חמיקה חיסונית של גידולים.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת וריאנטים של gp96 או שילובים של אדג'ובנטים על פני סוגי אנטיגנים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד העזר (adjuvant) על ידי קישור פעילות מולקולרית לתוצאות תפקודיות של תאי T.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד לוקוציטים, דופק (pulsing) והעברה לצורך עיגון חיסוני (immune priming) הניתן לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת ראיות מוקדמות in vivo להפעלה חיסונית ספציפית לאנטיגן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מבנים מבוססי gp96 בהתאם לסיכון, על בסיס מדדי השהיית התפתחות הגידול (tumor challenge delay).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול Xenopus, שטיפת פריטונאית וטכניקות של העברת תאים אדופטיבית (adoptive cell transfer).
- תלוי בגישה ל-PBS סטרילי עבור דו-מינים, תכשירים של אנטיגן gp96, ותורמים של גידולים או השתלות עור.
- מחייב דירוג סטנדרטי של דחיית השתלה ומדידת גידול לצורך השוואה בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למודלים של אנטיגנים אחרים או למקורות לוקוציטים שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בקרפדות קלונאליות עם MHC מוגדר כדי לפרש במדויק את קינטיקת הדחייה והגידול.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:24
Introduction
2:12
Elicitation and Harvest of Peritoneal Leukocytes (PLs)
3:43
Pulsing and Adoptive Transfer of LG-6 PLs into Naive LG-6 Recipients
5:20
Skin Graft Assay
7:14
Tumor Transplantation Assay
7:56
Collecting Blood Leukocytes
8:58
Skin Graft and Tumor Transplantation Results
10:34
Conclusion
