מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר תרביות של אפיתל הפיגמנט של הרשתית העוברית האנושית, או RPE, שניתן להשתמש בהן כמודל. בחקירות של מחלות עיניים אנושיות, רקמות מתקבלות מתורמים כגלגלי עיניים שלמים. השלב הראשון של ההליך הוא להסיר שרירים ורקמת חיבור עודפות, ולאחר מכן לפתוח את העין על ידי הסרת הקרנית והעדשה.

את העין מטפלים ב-dispa ומשטחים, ולאחר מכן קולפים את השכבה החד-שכבתיות של ה-RPE מהכורואיד. את תאי ה-RPE המבודדים זורעים בבקבוקון תרבית ומגדלים במשך מספר שבועות עד להגעתם לשכבה חד-שכבתיות צפופה (confluent monolayer) ולפיתוח פיגמנט. תרביות התאים משמשות לניסויים תפקודיים in vitro.

ניסויים מוצלחים in vitro חוזרים על עצמם במודלים של בעלי חיים בניסויים פרה-קליניים, שבהם ניתן להעריך טוב יותר את התגובות של ה-RPE בסביבות איתות מורכבות יותר. המודל המוצג כאן יוביל להבנה טובה יותר של פיזיולוגיית ה-RPE ולהתערבויות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות עיניים. שלום, שמי שלדון מילר.

המעבדה שלי ממוקמת במכון הלאומי לעיניים (National Eye Institute), שהוא חלק מהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) בקמפוס בת'סדה, מרילנד. שלום, אני ארקי ממעבדת מילר. היום נראה לכם הליך להכנת תרביות ראשוניות של תאי אפיתל של הרשתית העוברית האנושית.

תאים אלו יוכנו כשכבות חד-שכבתיות צפופות (confluent monolayers) שניתן יהיה להרכיב בתאי-סינג (sing chambers) משופרים. נשתמש בתאי RPE אנושיים מבודלים אלו גם למחקרים בביוכימיה ובגנטיקה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי להקים תרביות ראשוניות של תאי אפיתל, במטרה לחקור את התפקוד והוויסות של תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים ולפתח מודלים קליניים של מחלות בבעלי חיים.

אנו מתמקדים באפיתל הפיגמנט הרשתית או ה-RPE, הממוקם בחלק האחורי של העין ומפריד בין הרשתית העצבית לבין אספקת הדם של הכורואיד. תרשים זה של העין מראה את מיקומו של שכבת ה-RPE בחלק האחורי של העין, סמוך מאוד לפוטו-רצפטורים. התמונה המוכנסת מראה את תאי הרשתית, כאשר הפוטו-רצפטורים נמצאים מימין ותאי הגנגליון נמצאים משמאל.

אפיתל זה פעיל מטבולית באופן קיצוני. הוא מבצע פגוציטוזה של פוטורצפטורים באופן רציף ובבסיס יומי, והוא מאחסן, מעבד ומעביר את ויטמין A, הפיגמנט הראייתי, אל הפוטורצפטורים. במחזור הראייה, הוא פועל באופן הומאוסטטי כדי לשמור על ההרכב הכימי והנפח של החללים החוץ-תאיים הסובבים.

תכונה קריטית של תאי אפיתל היא הפולריות שלהם. ההובלה האסימטרית המתמשכת של חלבונים לממברנות האפיקליות והבסאליות-לטרליות היא תהליך מווסת המאפשר לאפיתל לבצע תעתוע וקטורי של מטבוליטים, יונים ונוזלים מחלל חוץ-תאי אחד לאחר. פעילות זו מסייעת לאפיתל לשמור על בריאותם ושלמותם של תאי הרשתית העצבית.

ההכנה במעבדה (in vitro) המתוארת כאן מאפשרת ניתוח של חלבוני תובלה, רצפטורים ומסלולי איתאות הקובעים את הפולריות והתפקוד האפיתליים לפני תחילת הנתיחה. הכינו פלטת 12 בארות במנדף זרימה למינרית עם תמיסות בטמפרטורת החדר. לכל עין נדרשת בארה אחת של תמיסת antibiotic antimycotic בריכוז 10x, שתי בארות של 1x PBS ובארה אחת של 2 units per milliliter של disc space המדולל בתווך 5%RPE עם סרום. מלאו צלחת נתיחה עם ריפוד סיליקון ב-1x HBSS, רוקנו את הנוזל והעבירו כל עין לבארה אחת של תמיסת antibiotic antimycotic.

דגרו למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הימנעו מהפעלת לחץ מופרז על גלגל העין. שטפו את העין בשני בארי (wells) עוקבים של XPBS כדי להסיר אנטיביוטיקה עודפת.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה להעברה של העין לכלי ניתוח המולא ב-one X-H-B-S-S תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו במספרי איריס להסרת שרירים ורקמות חיבור עודפות מסביב לעין. יישרו את העין כך שהקרנית תפנה כלפי מעלה.

השתמשו בשתי מחטים סטריליות בכי মাপ 27 כדי להקבע את העין לפד הסיליקון באמצעות רקמת חיבור, מבלי לפגוע בסקלרה. במנח זה, השתמשו בסכין לפתח צד (side port knife) כדי לבצע חתך דרך הסקלרה. החתך צריך להיות במרחק של שליש מהמרחק שבין קו המש equator של העין לבין השטח הקדמי.

השתמש במספרי איריס כדי להמשיך את החיתוך באופן מעגלי מסביב לעין כדי למנוע נזק לאפית הפיגמנט של הרשתית, המקוצרת כ-RPE, כתוצאה ממשיכה של הרשתית והזגוגית. השתמש באותם מספריים כדי לחתוך דרך הגוף הזגוגית כדי להפריד את השטוח הקדמי של העין מגביע העין.

הרם את החלק הקדמי של ה-IOA והשלח אותו. השתמש בפינצטה כדי להעביר את העין הפתוחה אל תוך באר ה-dys. ודא שאין בועות אוויר בעין.

דגרו למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. העבירו את העין מהחלל המוגדר בחזרה לכלי הנתיחה, שמולא ב-1X HBSS טרי בטמפרטורת החדר. מקמו את העין כאשר הגביע פונה כלפי מעלה וקבעו אותה באמצעות 2 מחטים בקוטר 27 gauge.

תחת מיקרוסקופ dissection, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להרים בעדינות את הרשתית המופרדת חלקית באמצעות מספרי רשתית. גזרו את הרשתית מהעצב האופטי. השליכו את הרשתית באמצעות מספרי קשתית.

בצעו חתך מהיקף העין אל העצב האופטי. קבעו את העין באמצעות 5 מחטים בכיסוי 27 gauge. כדי למתוח את שכבת ה-RPE, השתמשו במספרי רשתית כדי לבצע חיתוך מעגלי מסביב לעצב האופטי.

הפרדת שכבת ה-RPE תוך מעבר להגדלה של 250x או יותר. אתרו את קצה גיליון ה-RPE לאורך החתך שבוצע על ידי מספרי האיריס ובסמיכות לעצב optic nerve. השתמשו בשני זוגות פינצטות כדי להפריד את ה-RPE ואת ממברנת ברוס (Bruch membrane) משכבת רקמת הכורואיד.

נסו מספר אזורים לאורך קצה החיתוך כדי למצוא את הנקודה שבה הקשר בין ה-RPE לטחול (choroid) הוא החלש ביותר. קלפו בעדינות את הממברנה לאחור כדי להסירה לחלוטין. העבירו את דפי ה-RPE למבחנה קונית בנפח 15 milliliter הממולאת ב-trypsin EDTA בטמפרטורת החדר.

כאשר כל הדפים נאספו, סגרו את השפופרת במכסה, והדגירו את השפופרות בבן-מריא למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. נערו את השפופרת בעוצמה כדי להפריד את ה-RPE לצבירים קטנים. היעדרם של גושי תאים כהים מעיד על כך שההפרדה הושלמה.

החזירו את המבחנה למקלח המים למשך חמש דקות נוספות. השתמשו בפסטור, בפיפטה ובשאיבה עדינה כדי להסיר שאריות רקמה שלא עוכלו. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-280 5G למשך ארבע דקות.

הסר את הנוזל העליון (supernatant). השלם את הנפח הסופי לתשעה מיליליטרים באמצעות מצע 15%RPE וערבב בעזרת פיפטה כדי לתלות מחדש את התאים. העבר בעזרת פיפטה שלושה מיליליטרים של תגלי התאים לבקבוק תרבית (flask) של 25 סנטימטר רבוע.

הוסיפו שני מיליליטרים של מצע תרבית 15% RPE טרי בטמפרטורת החדר. השאירו את התאים למשך לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% carbon dioxide. ככל שהתרביות יבשילו, הפיגמנטציה שלהן תגבר לאחר שלושה עד ארבעה שבועות.

תרביות מוצלחות יהיו קונפלואנטיות ובעלות פיגמנטציה עזה ואחידה. כעת הצגנו בפניכם כיצד להכין תרביות ראשוניות של RP עוברי אנוש. זהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.