פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות abers מספרייה אקראית, הנקשרים באופן ספציפי לחלבון מטרה, ובמקרה זה, חלבון S 100 B. הדבר מושג תחילה על ידי עיכול של הספרייה באמצעות אנדונוקלאז הגבלה כדי לשחרר רצפים אקראיים מרצפי פריימרים קבועים המקיפים אותם. השלב השני של ההליך הוא קישור של רצפי הספרייה האקראית לחלבון S 100 B מנוקה והשבתם.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא חיבור מחדש של הרצפים הקשורים לרצפי פריימר מקובעים באמצעות היברידיזציה וליגציה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא שעתוק המוצרים שעברו ליגציה כדי לאפשר הגברה חוזרת באמצעות R-T-P-C-R של המאגר הקשור של ה-abers המועמדים, ולאחריה סבבים נוספים של פרוצדורת בחירה זו. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קישור ספציפי של abers נבחרים לחלבון S 100 B.

לדוגמה, כאן, בדיקות קישור מסוג סנדוויץ' מבוצעות באמצעות מערכי מיקרו (microarrays), ובדיקות של נוגדנים שניים המסומנים פלואורסצנטית מבוצעות גם באמצעות ננו-חוטים פונקציונליים ונוגדנים שניים המצומדים לננו-חלקיקי זהב בגודל 15 nanometer. היום נציג פרוצדורה לבחירת רצפים אופטימליים הנקשרים לחלבון S hundred B מתוך ספרייה אקראית של רצפי D. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו למגוון מטרות, כולל פיתוח פלטפורמת חיישן לגילוי מוקדם של סרטן.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, יש להכין ספריית DNA ללא פריימר (primer free או PF) כפי שתואר בעבר. שבירה של ספריית ה-DNA דו-גדילית, ולאחריה טהרה בג'ל פוליאקרילאמיד דנטורנטי בריכוז 10%, תניב מקטע של 32 נוקלאוטידים עם פוספט ב-5', ומקטע של 30 נוקלאוטידים עם פוספט ב-5', אשר יוגדרו כפרגמנטים 32+ ו-30+ בהתאמה.

הפרגמנט 32 פלוס מכיל את הדומיין האקראי של 30 נוקלאוטידים עם רצף האגף המינימלי של CC בקצה של'ה שורה (3'), בעוד שהפרגמנט 30 פלוס מורכב אך ורק מרצף הדומיין האקראי של 30 נוקלאוטידים. כדי להכין את פרגמנטי ה-DNA של ספריית ה-PF לבחירת aptr, השעה מחדש כל אחד מהפרגמנטים 32 פלוס ו-30 פלוס ב-40 µL של 20 mM Tris, HCl pH 7.4. לאחר מכן, חמם את הדגימות למשך שלוש דקות ב-85 °C לאחר הדגירה.

קררו את הדגימות במשך שלוש דקות במקטורן עם רחצה בטמפרטורה של 37 °C, לאחר מכן הוסיפו 760 µL של באפר סלקציה והדגירו למשך שלוש דקות ב-37 °C. לאחר שלוש דקות, השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר ההדגרה, העבירו את התמיסה דרך עמודה המכילה חרוזי agarose ניקל NTA שנשטפו מראש בבאפר סלקציה.

כדי להסיר DNA לא ספציפי, אספו את מקטעי ה-DNA של ספריית ה-PF שאינם נקשרים לעמודה ושמרו אותם להמשך. כדי להכין את החרוזיים הקשורים ל-S 100 B, סובבו תחילה 400 µL של חרוזי ניקל NDA למשך שלוש שניות במיקרו-צנטריפוגה והשליכו את העל-מיסל (supernatant). לאחר מכן, שטפו את החרוזיים עם 400 µL של תמיסת קישור באמצעות פיפטינג עדין חמש פעמים.

לאחר מכן, סבבו את החרוזיים בצנטריפוגה להורדתם לתחתית המבחנה והסירו את הנוזל העליון. חזרו על פעולה זו. שטפו פעמיים.

לאחר מכן, העבירו חלבון בעל תג histidine שטוהר בעבר מעל לחרוזים. במקרה זה, נעשה שימוש בחלבון human S 100 calcium binding protein B. העבירו את התמיסה בעדינות למעלה ולמטה בעזרת פיפט חמש פעמים בכל שלוש דקות, למשך 15 דקות בסך הכל.

לאחר 15 דקות, סובבו את החרו지를 בצנטריפוגה והשליכו את הנוזל העליון. לבסוף, שטפו את S 100 B הקשור לחרוזים באמצעות 400 µL של תמיצת בחירה, על ידי תנועות עדינות של מעלה ומטה של הפפיט שלוש פעמים. שוב, סובבו את החרוזים בצנטריפוגה והשליכו את הנוזל העליון.

חזור על שלב זה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות סופיות, כדי לבחור את ה-abers הקשורים ל-S 100 B. שלוף את מקטעי 32 plus ו-30 plus שהוצבנו בצד קודם לכן. הוסף את המקטעים ל-S 100 B הקשור לחרוזים. לאחר מכן, דגור את הדגימה למשך 15 דקות.

בצע ערבוב כל שלוש דקות על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה. לאחר 15 דקות, סובב את החרוזיים קצרות בצנטריפוגה, השלך את הנוזל העליון, ולאחר מכן שטוף את קומפלקס ה-S 100 BDNA עם 800 microliters של תמיפת סלקציה (selection buffer) באמצעות פיפוט עדין. לאחר מכן, סובב את החרוזיים בצנטריפוגה והשלך את הנוזל העליון. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים.

כדי להפיק את ה-S 100, יש להוסיף לחרוזי הניקוי 200 µL של tris, HCL בריכוז 20 mM וב-pH 7.4. לאחר מכן, יש לחמם את התערובת במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 85 °C. לאחר האינקובציה.

ערבבו את החרוצים ב-Vortex למשך דקה אחת והסמירו אותם בצנטריפוגה. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה. חזרו על שלב זה פעם אחת ואחדו את הנוזלים העליונים.

לבסוף, טהרו את מקטעי ה-DNA הנבחרים. חילוצו את תוצרי ה-PCR פעמיים עם נפח שווה של phenyl chloroform ו-isopropyl alcohol. שקיעו אותם עם 250 millimolar sodium chloride ונפח של 2.5 פעמים 100% Ethanol בטמפרטורה של minus 70 degrees Celsius למשך 15 דקות.

בצע ספינטדאון במהירות של 21,000 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, השליך את הנוזל העליון (supernatant). שטוף את המשקע (pellet) ביעילות עם 75% ethanol.

סבבב ב-21,000 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והסר את הנוזל העליון. ייבש את המשקע במכשיר SpeedVac למשך שלוש דקות לאחר 10 סבבי ברירה. שבט את מקטעי ה-DNA המוגברים ב-PCR שהתקבלו אל תוך וקטור PCR 2.1 topo שהושג מ-Vitrogen Core.

לאחר מכן, בצעו ריצוף של 40 עד 50 מושבות בודדות עבור כל אחד מהמקטעים שנבחרו של N 30 cc ו-N 30 באמצעות הפריימר M 13 forward. יישרו את הרצפים שנבחרו באמצעות תוכנת infomax vector NTI. לאחר מכן, קבעו את רצפי הקונסנסוס על בסיס היישורים.

לאחר זיהוי רצפי הקונצנזוס, רכשו אברים (abers) של קונצנזוס כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. תמיסו את האפטמר הראשון שסונתז עם קבוצת Amin C6 בקצה ה-5' בבופר הדפסה (printing buffer) עד לריכוז סופי של 15 micromolar. לאחר מכן, טפטפו את תמיסת האפטמר על שקופיות מופעלות ב-code link באמצעות מערך microgrid של apogen discoveries.

יש לפעול לפי הפרוטוקולים המומלצים בקישור לקוד. הדפיסו כל שקופית עם 12 מערכים. השתמשו בפורמט של שתיים על שמונה.

קסת היברידיזציה של מערך מיקרו (Microarray) עבור היברידיזציה. דללו את חלבון S 100 B לריכוז המתאים ב-70 µL של PBS. לאחר מכן, יישמו את התמיסה על בארות קסת מערך המיקרו.

אטמו את קסדרת המיקרו-מערך (microarray) באמצעות רדיד איטום דביק ללא נוקלאז כדי למנוע התאיידות. אפשרו לחלבון להיקשר לנוגדנים המודפסים על השקופית במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו אינקובציה בנפרד.

שטפו את בארות הקסטה שלוש פעמים עם PBS עם חמישה מילימולר מגנזיום כלוריד או PBSM. לאחר מכן, דללו את הנוגדנים המשניים המסומנים פלואורסצנטית ל-0.125 micromolar ב-70 microliters של PBSM. חממו את התערובת למשך שלוש דקות ב-85 degrees Celsius.

לאחר מכן, יש להניח ל-ABERS המסומנים להתקרר על קרח. למשך שלוש דקות, יש להחיל את ה-ABERS על בארות קסטת המיקרומערך (microarray cassette). שוב, יש לאטום את הקסטה בעזרת רדיד הדבקה ולהדגיר אותם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שוב, באופן פרטני. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBSM לאחר השטיפה. פרקו את הקסטרה ושטפו את השקף כולו ב-PBSM.

לאחר מכן, ייבשו את השקופית ביסודיות באמצעות צנטריפוגה. לבסוף, סרקו את השקופית באמצעות מערך סריקה של Packard Biosciences. קשירה של 4,000 XL נקבעה עבור אפטמרים המסומנים בקצה 5' ב-gamma P 32 A TP מול חלבון S 100 B, והתוצאות שורטטו כנגד הריכוז לקביעת KD.

ערכי Kd מייצגים לאחר כשבעה סבבי ברירה הם בדרך כלל בטווח של 10⁻⁷ מולרי. אפטמרים ראשוניים בעלי קצה 5' מכוון חוברו למערכי מיקרו של code link. חלבון S100B מפוהו נקשר לאפטמר הראשון, ואפטמר שני המסומן ב-LOR 546 נקשר לקומפלקסים של S100B והאפטמר הראשון.

הפלואורסנציה נמדדה כמותית באמצעות סורק מערך סריקה. השורה האמצעית מראה קישור סנדוויץ' המאופיין בקישור אדיטיבי במבחני KD בשורות שמעליו ומתחתיו. אין קישור סנדוויץ' עבור abers חמיש-פריים עם נגזרת תיול; ה-abers הראשונים הוצמדו לננו-חוטי זהב באמצעות כימיית תיול סטנדרטית.

נוגדנים שניים חוברו ל-50 NMO או ל-gold nps באותו אופן. לאחר מכן, חלבון S 100 B מנוקה נקשר תחילה לננו-חוטים הנגזים; לאחר מכן נקשרו aptamer 50 nano molar gold mps לקומפלקסים של S 100 B על ננו-חוטי האפטמר הראשונים. קומפלקסי סנדוויץ' קשורים הודגמו באמצעות F FE SEM.

ניתן לראות ביקורת שלילית עבור בדיקת קישור שבוצעה עם חלבון HTRA one במקום חלבון S 100 B. אוקיי, אז אחד הדברים החשובים ביותר בנוגע לפרוצדורה הוא שאנו משתמשים בגישה ללא פריימרים, שבה אין לנו רצפים קבועים שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות ותוצאות שליליות שגויות על בסיס הרצפים עצמם, השולטים באזור האקראי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שתבנית ה-DNA הושמדה לפני כל תגובת שעתוק הפוך, ולהקפיד לבודד את תוצר ה-R-T-P-C-R הספציפי לאחר כל הגברה מחדש.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.