דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)
17 באוקטובר 2010
שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.
סרטון זה מדגים פרוצדורה לביצוע דימוי דיפרנציאלי של שתי תהודות רמון הקשורות למבנים ביולוגיים בעלי אותות פיזור רמון קוהורנטיים. ראשית, שלושה לייזרים של פולסים קצרים מסונכרנים מוחלפים בזמן ובמרחב. הפולסים המוחלפים נשלחים לאחר מכן למיקרוסקופ הפוך סטנדרטי, המאפשר יצירה של אותות רמון קוהורנטיים מאובייקטים מיקרוסקופיים.
אותות ממירים לתמונות באמצעות תוכנה מסחרית על מנת להשוות בין אותות רמון שונים שנוצרו. התוצאות מעידות כי ההבדל בין תמונות שהתקבלו מאותות רמון בעלי תהודה כפולה לעומת תהודה בודדת מספק רגישות מוגברת לאותות רמון חלשים. שלום, אני טיילר ויקס מהמרכז לפוטוניקה ביולוגית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס.
אני תומס ER מהמרכז לפוטוניקה ביולוגית והמחלקה לרפואה פנימית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. היום נראה לכם הליך לשימוש בפיזור רמון אנטי-סטוקס קוהורנטי עם תהודה כפולה (doubly resonant coherent anti-Stokes Raman scattering) להפקת תמונות ספציפיות מבחינה כימית של תאים. אנו משתמשים בהליך זה כדי לזהות אותות ממולקולות שהם חלשים מכדי להיות מזוהים ישירות על ידי ספקטרוסקופיית רמון אנטי-סטוקס קוהורנטית לבדה.
אם כך, נתחיל. כדי להפיק אותות CAR ו-Dr CAR בו-זמנית, נדרשים שלושה מקורות לייזר בעלי פולסים קצרים, הניתנים לכוונון ומסונכרנים. כדי להשיג את הפולסים המסונכרנים הללו, נתחיל עם לייזר פולסים קצרים בודד בעל הספק פלט של 10 watts, אורך גל קבוע של 1064 nanometers, משך פולס קבוע של שבעה picoseconds וקצב חזרות קבוע של 76 megahertz.
באמצעות סדרה של לוחות חצי-גל (half wave plates) וקוביות מפליל קרן מקטב (polarizing beam splitter cubes), הקרן מופסלת לשלושה חלקים. לוח חצי-גל בשילוב עם קוביית מפליל קרן מקטב מאפשרים כיוונון של כמות ההספק בכל רכיב של הקרן מבלי לשנות את כיוונה. בדרך כלל, שתי קרניים מכווננות לכ-4.5 watts כל אחת, והקרן השלישית מכילה את הוואט הנותר.
שתי קרני ההספק הגבוה מופנות לאחר מכן לשני מתנדים פרמטריים אופטיים (OPOs) עצמאיים. OPOs משתמשים ביצירת תדרים שונה כדי להמיר פוטון בעל אנרגיה גבוהה לשני פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה יותר ובאורכי גל שונים. על ידי בקרת הטמפרטורה של הגביש המשמש להשגת אפקט זה, ניתן לשלוט באורכי הגל של הפוטונים שנוצרו בדיוק של עד 0.1 nanometers.
באמצעות הכפלת תדר של אותות אלה, ניתן כעת להפוך לייזר בעל אורך גל קבוע של 1064 nanometers לקרן לייזר שניתן לכוון לכל נקודה בין 780 nanometers ל-910 nanometers, על ידי הזרעה של שני OPOs נפרדים מאותו מקור של 1064 nanometer. כך מתקבלים שני מקורות לייזר הניתנים לכוונון באופן עצמאי, המסונכרנים אוטומטית ללייזר ההזרעה המקורי שלנו. הקרן השלישית מלייזר ההזרעה של 1064 nanometer מופנית מסביב ל-OPOs באמצעות שילוב של מראות דיאלקטריות, כך שניתן יהיה לאחד את כל שלוש הקרניים מאוחר יותר.
על מנת להפיק ביעילות פוטונים קוהרנטיים של אות ראמן (ramen), יש להחפיף את הפולסים המאוחדים הן מבחינה זמנית והן מבחינה מרחבית, מכיוון ש-OPOs מכילים חללי טבעת המאפשרים לכל פולס לייזר לעבור דרך הגביש מספר פעמים; הקרן הנשלחת דרך ה-OPOs עוברת מרחק נוסף, מה שגורם לעיכוב ניכר ביחס לקרן המשאבה המקורית. יש לפצות על מרחק זה באמצעות קרן שלישית, על ידי הכנסת מראות נוספות המאלצות קרן זו לעבור את אותו המרחק כמו שתי הקרניים האחרות לפני שהן מאוחדות באמצעות מראות דיכרואיות, וזאת כדי לאפשר כיוונון עדין של אורך המסלול. כל קרן נשלחת דרך שלבי עיכוב מתכווננים, המאפשרים כיוונון של החפיפה הזמנית בין פולסי הלייזר השונים.
סט נוסף של לוחות חצי-גל (half-wave plates) וקוביות של מפליט קרניים מקטב (polarizing beam splitter) מתווספים לכל קרן כדי לאפשר כוונון עצמאי של הספק הלייזר של כל קרן. מראות דיכרואיות משמשות תחילה לאיחוד הקרניים משני ה-OPOs, ולאחר מכן את קרן ה-1064 nanometer; יש להקפיד לוודא שהקרניים חופפות בדיוק במרחב. ניתן לאמת זאת על ידי השוואת חפיפת הקרניים במרחק של סנטימטרים ספורים מהמראה הדיכרואית לעומת חפיפתן במרחק של כמעט מטר מהמראה הדיכרואית.
מכיוון שחשיפה לקרני לייזר בעלות הספק ממוצע גבוהה עלולה לפגוע בדגימה, שלושת הקרניים המשולבות מועברות דרך מודולטור אופטי חשמלי המתפקד כבורר פולסים (pulse picker), המאפשר כיוונון של קצב החזרת הפולסים המגיעים לדגימה, ובכך כיוונון של ההספק הממוצע. קרני הלייזר המשולבות מוזנות לאחר מכן לתוך מיקרוסקופ הפוך עם עדשת אובייקטיב בעלת מפתח מספרי גבוה, או na. המיקוד ההדוק הנוצר על ידי עדשת האובייקטיב בעלת ה-NA הגבוה מאפשר את הייצור היעיל ביותר של אותות רמן קוהורנטיים בקני מידה מיקרוסקופיים.
עדשת העדשה של המיקרוסקופ מורכבת על במה פייזו (pizo) בצירים X, Y, Z, המאפשרת השגת תמונות על ידי סריקת רסטר (raster scanning) של הקרניים על פני הדגימה, בדומה למיקרוסקופים קונפוקאליים מסחריים עם סריקת קרניים. כעת נראה כיצד להפיק אותות CARS ו-DRFM. האינטראקציה של שלוש קרני לייזר בפולסים קצרים עם הדגימה גורמת להפקה של מספר אותות של ערבוב ארבע גלים (four wave mixing), כגון CARS מהשילובים השונים של שני לייזרים, וכן אותות Three-color CARS ו-DR CARS מהשילוב של שלושת הלייזרים. כאשר האותות קרובים יחסית באורך הגל שלהם, הפרדתם לצורך אנליזה עלולה להיות קשה.
מסיבה זו, האותות מועברים לספקטרומטר דימוי המשמש גם כמונוכרומטור או כמסנן מעבר פס (band pass filter) כדי להפריד מרחבית אותות באורכי גל שונים. מראה מתהפכת המופעלת אלקטרונית בתוך הספקטרומטר, במצב מורד, שולחת את האות למצלמת CCD (מכשיר צימוד מטען) בעלת התרוקנוּת עמוקה ותאורה אחורית, המספקת מידע ספקטרוסקופי לכל טווח האותים, ומאפשרת לנו לזהות ולבצע אופטימיזציה לאותות ה-robin הקוהרנטיים השונים כדי לבחור את האות להדמיה. פשוט סובבו את הסריג בתוך הספקטרומטר באמצעות תוכנת הבקרה ורכישת הנתונים המסופקת על ידי הספק כדי למרכז את השיא הרלוונטי במצלמת ה-CCD.
לאחר מכן, שנו את מיקום מראת ההיפוך כדי להפנות את האות ליציאה שנייה שבה מחוברת גלאי פוטון בודד מסוג Avalanche Photo Diode (APD) או PD. בצעו סריקת רסטר (Raster scan) של עדשת העדשה, ולאחר מכן השתמשו באותים שהוקלטו ב-APD כדי להפיק תמונה על ידי הצגת קצב ספירת הפוטונים עבור כל פיקסל באמצעות תוכנת רכישת הנתונים. חזרו על הליך הדמיה זה עבור כל אות Raman קוהרנטי רצוי, כך שניתן יהיה להשוות בין האותים במהלך עיבוד הנתונים לאחר הניסוי.
כעת נראה כיצד להכין את הדגימה בצורה נכונה כדי לקבל תמונות ברורות הניתנות לשחזור. יש לנקוט במשנה זהירות בהכנת הדגימות. הדגימות מוכנות בדרך כלל על לוחות כיסוי מזכוכית בעובי של כ-150 micron.
לוחיות כיסוי אלו דקות מספיק כדי לאפשר דימוי ברזולוציה גבוהה באמצעות עדשות אובייקטיב עם NA גבוה בטבילת מים או שמן, המשמשות בניסויים אלו. כדי להדגים את הכנתו של דגימה טיפוסית, אנו מכינים חתכים בעובי של כ-20 micron של רקמת שריר של עכבר המקובעים לעליית מיקרוסקופ. טיפה של 20 microliter של תמיסת גלוקוז דאוטריום בריכוז five molar מתווספת לדגימה.
תמיסת הגלוקוז הדאוטרד מספקת חתימת רקע רמנית ייחודית וחזקה. כיסוי זכוכית (cover slip) מונח מעל הדגימה ומקובע במקומו באמצעות לק ציפורניים עבור התאים והתרבית. ניתן להשתמש בצלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית, המאפשרות דימוג ללא צורך בניתוק התאים מתוך צלחות גידול תרבית התאים שלהם.
כעת נראה כיצד לקבוע את פסגות ה-Raman המתאימות עבור Dr cars. כדי לנצל כראוי את אפקט ההגברה של תהודה כפולה, יש להכיר את ספקטרי ה-Raman של שני החומרים הרזוננטיים. בדרך כלל, אלו הם 2,845 inverse centimeters הקשורים לליפידים ו-2,121 inverse centimeters עבור מצב המתיחה של CD הקשור לגלוקוז דויטרי.
פיזור רמן קוהורנטי מושג כאשר הפרש התדרים בין שני לייזרים תואם את תדר הרטט המולקולרי. על ידי כיוון של OPO אחד ל-817 nanometers, הוא יבחון את מצב ה-C ב-2,845 inverse centimeters כאשר הוא משולב עם קרן לייזר של 1064 nanometer, ועל ידי כיוון של ה-OPO השני ל-868 nanometers, הוא יבחון את ה-2,121 inverse centimeter כאשר הוא משולב עם קרן ה-1064 nanometer. במצב ספקטרוסקופי, מיקרוסקופ ה-CARS מאפשר לנו לצפות בשלושה אותות רמן קוהורנטיים רלוונטיים: אות CARS הבוחן את רטט המתיחה של CH, אות CARS הבוחן את מצב המתיחה של CD, ואות DR CARS הבוחן את שניהם. בדיאגרמה המוצגת כאן, חצים מקווקווים מציינים פוטונים מהלייזר ב-OPOs וחצים רצופים מציינים את האות שהתקבל.
הקווים האופקיים הרצופים מציינים את האנרגיה של רטט הראמן ומספקים ייצוג ויזואלי לכך שבמכוניות DR, ערבוב של אותם שלושה פוטונים קלטים בודק בו-זמנית שני רטטי ראמן שונים. יהיה צורך לבצע אופטימיזציה של עוצמת האות עבור כל שיא על ידי כיוונון בצעדים קטנים סביב מיקומי שיאים אלו. כאן אנו בוחרים בכל שיא ומצלמים תמונות של תולעי sea elgan בתמיסה של גלוקוז מוחדר; הפקת מידע נוסף בהסתמך על שלוש התמונות שהתקבלו בנפרד אלו דורשת עיבוד תמונות פשוט למדי.
ראשית, יש לנרמל את התמונות. שיטה מעשית לנרמול מתבססת על העובדה שליפידים הם הידרופוביים. משמעות הדבר היא שבvאזורים בעלי צפיפות ליפידים גבוהה, תהיה לתהודה של ה-CD מהגלוקוז תרומה מועטה מאוד לאות התהודה הכפולה.
לעומת זאת, באזורים של תמיסת גלוקוז טהורה, התהודות של CH מהליפידים צריכות לתרום מעט מאוד. בהתחשב בכך, נרמלו את תמונת ה-DR car ואת תמונת ה-car שהתקבלה מהתהודה של CD של תמיסת הגלוקוז הדאוטרביים לאזור שנמצא הרחק מחוץ ל-CL egan's worm, אשר לא אמור להפגין תהודת CH. לאחר מכן, זהו אזור בתוך התולעת בתמונת ה-car בעלת תהודת CH העשיר בליפידים, ונרמלו אותו לאזור המקביל בתמונת ה-DR car המנורמלת.
כדי ששיטה זו תעבוד כראוי, נניח שבאזור זה, בעומק, לא נוכח גלוקוז דאוטרלי. זוהי הנחה בטוחה מכיוון שהליפידים הם הידרופוביים ולא יתערבבו עם התמיסה. כעת, על ידי חיסור תמונת ה-car בעלת התהודה של CH הנורמלית מתמונת ה-car בעלת התהודה של DR הנורמלית, נותר רק אות התהודה המוגבר של CD; באופן דומה, על ידי חיסור תמונת ה-car בעלת התהודה של CD הנורמלית מתמונת ה-Dr.FWM הנורמלית.
רק האות המהודק של ה-CH נותר; מוצג כאן ספקטרום רמנ של חומצה אולאית שעברה שינוי הכולל מודיפיקציית אלקין. התהודדויות ה-CH החזקות ב-2,845 inverse centimeters והתהודדות האלקין ב-2,121 inverse centimeters מבודדות היטב מאזור טביעת האצבע, שהוא האזור בעל הפסגות הצפופות, מה שהופך אותן לסמנים אידיאליים לדימות רמנ קוהורנטי. זהו ספקטרום טיפוסי של אותות רמנ קוהורנטיים הנוצרים כאשר שלושה לייזרים של פולסים קצרים חופפים בתוך הדגימה. החיצים מצביעים על התהליכים האחראים לכל אות כפי שהם מיוצגים בתרשימי אנרגיה.
אלו הן תוצאות טיפוסיות מדימות של תולעי C Elgin באמצעות רכבים מסוג DR ורכבים רגילים. בשורה העליונה נעשה שימוש בשלושת האותות שהוצגו זה עתה כדי לדמות תולעת בתמיסת גלוקוז בריכוז מופחת. בשורה השנייה, התמונות נורמלו באופן מתאים, ובשורה השלישית הופקו תמונות הפרש על ידי הפחתת התמונות של כל רכב מהתמונה של רכב ה-DR. הרגע הצגנו כיצד לבצע דימות הפרש רמאן המבוסס על מיקרוסקופיית antis רמאן קוהורנטית בעלת תהודה כפולה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו שחשוב לוודא שהקרניים חופפות ומסונכרנות כראוי. כמו כן, בעת מעבר בין אותות קוהרנטיים שונים, יש להקפיד לא להזיז או להבליט את הדגימה, שכן הדבר ישפיע על הניתוח. זהו כל הפרוצדורה.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת פיזור רמון אנטי-סטוקס קוהורנטי (CARS) ו-CARS בעל תהודה כפולה (DR-CARS) באמצעות שלושה לייזרים מסונכרנים בעלי פולסים קצרים. הטכניקה משפרת את הרגישות לאותים רמניים חלשים, ובכך מקלה על דימוי של מבנים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביו-פוטוניקה
- טכניקות דימות
רקע
- פיזור רמאן קוהרנטי הוא טכניקת דימוי רבת עוצמה.
- גילוי של אותי רמאן (Raman) חלשים מהווה אתגר.
- שילוב של מספר מקור לייזר יכול לשפר את גילוי האות.
- טכניקות דימות הן חיוניות למחקר של דגימות ביולוגיות.
מטרת המחקר
- להדגמת פרוצדורה ליצירת אותות CARS ו-DR-CARS.
- לשיפור הרגישות לזיהוי מפזרי רמן חלשים.
- לספק תמונות בעלות ספציפיות כימית של תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בשלושה לייזרים בעלי פולסים קצרים מסונכרנים.
- חפיפה של פולסי הלייזר בזמן ובמרחב.
- שימוש בתנודתי פרמטריים אופטיים (OPOs) לכיוון אורך גל.
- ספקטרומטר דימוי להפרדה וניתוח של האות.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של אותות CARS ו-DR-CARS.
- הדגמה של רגישות משופרת עבור אותות רמן חלשים.
- יכולת להפיק תמונות בעלות ספציפיות כימית של מבנים ביולוגיים.
- השיטה מאפשרת דימיון יעיל של אובייקטים מיקרוסקופיים.
מסקנות
- השילוב של לייזרים משפר באופן משמעותי את גילוי אות ה-Raman.
- ניתן ליישם טכניקה זו במגוון יישומים של דימיון ביולוגי.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את היכולות של דימיון Raman קוהורנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו משפרת את הרגישות לגילוי מולקולות בעלות פעילות רמאן בריכוזים נמוכים במערכות ביולוגיות, על ידי ניצול הגברה של אותים ממפזרי אור שכיחים. היא מאפשרת דימות ספציפי מבחינה כימית ללא סימון ובלי תיוגים חיצוניים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בעת בחינת דינמיקה של ליפידים או התפלגות של סממנים דאוטריים במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מבנים עשירים בליפידים ומיקום של מולקולות דאוטרפיות ללא סימון, ובכך תומך בבדיקת היפותזות של יעדים במסלולי מטבוליזם של ליפידים.
- ערך תפעולי: מספק השוואה כמותית של אותות בין אופני רטט של CH ו-CD כדי להבהיר את ההתפלגות המולקולרית ברקמות מורכבות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תמונות מנורמלות עם הפחתת רקע, המגבירות אותות Raman חלשים של אנליטים בריכוז נמוך באמצעות אותים חזקים של ממס או מטריצה.
- ערך תפעולי: מאפשר ניגודיות הדירה ללא סימון (label-free) לסריקת השפעות של תרכובות על סדר ליפידים או שילוב של גששים דאוטריים בסביבות של תאים חיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך ברצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מעקב אחר ספיגת סמן דויטרי במערכות רלוונטיות למחלה, כגון *C. elegans* או חתכים של רקמות עכבר.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין אות סמן ספציפי לבין רעשי רקע באזורים עשירים בליפידים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה החל משלב הגילוי המוקדם ועד לשלבים הפרה-קליניים, שבהם דימות כימי ללא סימון (label-free) מספק מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ועל ויסות מסלולים לפני אופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על דינמיקה של ליפידים ומיקום של גשים דאוטריים באמצעות דימוי תהודה רטטית.
- סריקה: מאפשרת דימוי הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה של הבדלים בפיזור מולקולרי בין תנאי טיפול לתנאי ביקורת.
- אנליזה: מספקת פלטי סיגנל כמותיים ונורמליים המאפשרים השוואה של תרומות תהודה של CH ו-CD בין דגימות.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי דימוי של פיזור חומרי סמן במודלים של אורגניזם שלם כגון C. elegans.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמת דימוי ללא סימון, הניתנת לכיוון, והישימה בפרויקטים מרובים החוקרים מטבוליזם של ליפידים או ביזור ביולוגי של תרכובות דאוטריות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות בזיהוי אותות בריכוז נמוך.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זיהוי אותות באמצעות נורמליזציה והדמיה דיפרנציאלית, מה שמשפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מפחית את אי-הוודאות בהסרת סיכונים ביולוגיים במטרות הקשורות לליפידים, ומאפשר קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) טובות יותר בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המשפיעות על סדר ליפידים או על שימור סומן דויטרי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באופטיקה לא-ליניארית ובסנכרון לייזר עבור יצירת אות רמון קוהרנטי.
- תלוי במתנדים פרמטריים אופטיים הניתנים לכיוונון ובמיקרוסקופיה בעלת NA גבוהה להשגת חפיפה מרחבית וזמנית של הפולסים.
- מחייב הפרדת אותים מבוססת ספקטרומטר וגילוי באמצעות CCD או גילוי פוטון בודד לצילום ברזולוציית אורך גל.
- כולל שיקולים בהכנת דגימות עבור רקמות עשירות בליפידים ותאימות למסות דאוטריות.
- מוגבל על ידי הצורך בתהודות רמון ידועות והנחות של הפרדה הידרופובית/הידרופילית לצורך נורמליזציה.
