שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular
13 באפריל 2011
השתלה של איים מבודדים הוצע להיות טיפול פוטנציאלי עבור סוכרת מסוג 1. כאן אנו מתארים שיטה לבודד איים מהעכבר pancreata ואת השתלת אותם למרחב subcapsular של הכליה.
השתתלת איליים הוצעה כטיפול פוטנציאלי לסוכרת מסוג 1. עם זאת, שתי מגבלות עיקריות מונעות ממנה להפוך למציאות קלינית נפוצה. ראשית, נדרש מספר רב של איליים עבור כל מקבל.
מכיוון שאיים של לבלב מופקים מתורמי איברים, מספר המקבלים הפוטנציאליים מוגבל מאוד. השתלה שנייה מחייבת טיפול לכל החיים במדכאי חיסון חזקים, דבר המעמיד את המטופל, ובמיוחד את האוכלוסייה הפדיאטרית, בסיכון לממאירות, זיהומים וכשל כלייתי. השתלת איים של לבלב תחת קפסולת הכליה של עכבר מבוצעת כדי לבחון אסטרטגיות לשיפור תוצאות ההשתלה הקליניות.
איlets בודדו מעכברי תורמים בריאים, חולקו לקבוצות והוכנו להשתלה. לאחר מכן, ה-eyelets מושתלים לחלל התת-קפסולרי (subcapsular space) של הכליה. בעכברי מקבלים סוכרתיים, תפקוד הש Transplant של ה-eyelets מוערך על ידי ניטור רמות הגלוקוז בדם, המראות כי כ-250 עד 350 eyelets ישחזרו רמות סוכר תקינות (euglycemia) בעכבר מקבל במשקל 20 גרם בתוך 24 שעות מההשתלה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית עבור שלבי הקניולציה של צינור המרה המשותף והעברת הלולאות למרחב התת-קפסולרי של הכליה, שכן קשה ללמוד אותם. שלבים אלו דורשים זיהוי של מבני רקמה, ידיים יציבות ושימוש בטכניקה הממזערת את הנזק לרקמה.
הניחו עכבר שהורדם במצב גב (supine) על נייר סופג תחת מיקרוסקופ הדיסקציה ורססו את הבטן ב-70% ethanol. השתמשו במספריים כדי לפתוח את הבטן באמצעות חתך בצורת V מאזור הפוביס ועד לשתי הרגליים הקדמיות. העכבר נמצא מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
מקמו את הדגימה כך שהראש פונה לעבר הצופה. אתרו את פתח הכניסה של צינור המרה המשותף לתריסון באמצעות תפס המוסטט, פתח התריסון של צינור המרה המשותף. יש למקם את ההמוסטט כך שבזמן לחיצה, הוא יעבור בדיוק לאורך הגבול שבין הלבלב למעי.
כאן יודגמו שתי שיטות לקיבול (cannulation) של תעלת המרה: שיטת היד החופשית ושיטת הסיוע באמצעות פינצטה. בשימוש בשיטת היד החופשית, משכו את ההמוסטט המוצמד לתריסריסון הרחק מראש העכבר לכיוון הזנב, כך שתעלת המרה המשותפת תימתוח.
קיים התמזגות בצינור המרה קרוב לכבד, שם נפגשות המרה המתנקזת מכיס המרה ואנזימים מהכבד. לפני הכניסה למעיים, משכו את צינור המרה כדי לחשוף את החלק הפנימי של מיקום ה-V. השתמשו במחט כיפופה בכי মাপ 27gauge המחוברת למזרק של 5 mL, כך שהמחט תחליק ישירות דרך ה-V ותבצע קניולציה של החלק התחתון של הצינור. החליקו את המחט מספר מילימטרים מעבר לקצה הbevel כדי למנוע זרימה חוזרת לכבד ולכיס המרה.
לאחר שהקנולציה הצליחה, יש לבצע פרפוזיה ללבלב על ידי הזרקת שני מיליליטר של liase מהמזרק. יש לשים לב להתרחבות הלבלב מעל הקיבה כאינדיקציה לקנולציה אופטימלית. לחלופין, ניתן לבצע קנולציה לתעלת המרה.
באמצעות שיטת מלקחי הציסטה. משכו את ההמוסטט C המהדק את התריסריון הרחק מראשה של העכבר לכיוון הזנב, כך שצינור המרה המשותף יהיה מקומט. לאחר מכן, בעזרת מחט כיפופה מדגם 27 המחוברת למזרק של 5 mL, נקבו את הפציה מתחת לצינור המרה המשותף קרוב לכבד.
השתמשו במחט כדי לנקות את הפסציה מהתעלה כאשר המחט עדיין במקומה. הניחו את ההמוסטט וקחו פינצטה. השתמשו בזרוע אחת של הפינצטה הפתוחה כדי לתמוך בתעלת המרה במקום שבו המחט ניקתה את הפסציה, תוך משיכת התעלה והפינצטה קדימה.
החליקו את המחט אל תוך הניצב תוך שימוש בפינצטה כמשענת. קנולציה מוצלחת תתבטא בהתרחבות אחידה של אזור הלבלב מעל הקיבה. לאחר פרפוזיית הלבלב, הסירו את ההמוסטט מהתריסריון.
לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להרים את התריסריון (duodenum) ובזוג פינצטות שני כדי להפריד את הלבלב מהמעיים. בשלב הבא, משכו את הלבלב כדי לשחררו מהחלק העליון של הקיבה ומהטחול. לבסוף, הרימו את הלבלב אל מחוץ לבטן וחתכו את שאריות חיבורי הפציה למעי, לקיבה ולטחול.
הניחו את הלבלב במבחנה קונית של 50 מיליליטר והניחו אותה על קרח. דגרו את הלבלב בטמפרטורה של 37 °C לפי ההוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף. לאחר הדגירה, הוסיפו למבחנות 20 מיליליטר של מצע ופרקו את הרקמה על ידי ניעור חזק של המבחנות 40 פעמים במשך 10 שניות.
שלב זה קריטי עבור התאוששות אופטימלית של הויולט. סובב את התאים ב-800 rotations per minute. השהה את המשקעים ב-15 milliliters של מדיום ורכז את הדגימות.
שפכו את תמיסת הסלרי (slurry) לאחר השספension דרך רשת חוטים של 0.419 מילימטר והעבירו אותה למסננת לתוך פפלת קונית נקייה של 50 מיליליטר. שטפו את הפפלה הראשונה עם 10 מיליליטר נוספים של מדיום המכיל 10% fetal bovine serum ושפכו אותם דרך רשת החוטים. רספו את התאים על ידי סנטריפוגציה, השספנו את המשקע בחמישה מיליליטר של HBOPaque בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבבו בעזרת וורטקס בעדינות למשך מספר שניות, הוסיפו חמישה מיליליטר נוספים של HBOPaque סביב הדופן הפנימית של הפפלה כדי לשטוף את התאים מדופן הפפלה. העבירו באיטיות באמצעות פיפטה 10 מיליליטר של RPMI ללא סרום במורד דופן הפפלה, בקצב של מיליליטר אחד לכל 10 שניות.
ממשק חד אמור להיות נראה לעין. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה עם סלסלאות נדנדות (swinging bucket centrifuge) בטמפרטורה של 20 °C ובכוח של 900 ×g למשך 20 דקות, עם האצה איטית מאוד וללא בלימה. לאחר הצנטריפוגציה, יש להפריד את האיים (islets) מהתאים האקסוקריניים באמצעות פיפטה סרולוגית חד-פעמית של 10 mL. העבירו את האיים מממשק מדיום ה-histo Paque לשפופרת קונית נקייה של 50 mL.
ניתן לאחד מספר מבחנות בשלב זה כדי להסיר שאריות של איעלטים, למלא את המבחנות התעלקותיות במדיום המכיל סרום, ולשקע את האיעלטים על ידי סבב של המבחנות בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 800 סל"ד. לאחר מכן, השביו את האיעלטים במדיום טרי. חזרו על שלב זה לפחות פעמיים.
שַסְעו את המשקע בחמישה מיליליטר של מצע. הניחו מסננת תאים מניילון של 0.1 מילימטרה בצורה הפוכה על גבי מבחנה קונית של 15 מיליליטר. העבירו בפיפט את תמיסת התאים המשוערת דרכה כדי לאסוף את ה-eyelets.
לאחר מכן, שטפו את המבחנה בנפח 50 מיליליטר עם שישה מיליליטרים נוספים של מצע ועבירו אותם דרך המסננת. הניחו טיפה של 3 מיליליטר מצע בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים. הפכו את מסננת התאים וטבלו אותה בטיפת המצע כדי לאסוף את העיןולטים; השתמשו בפיפטה כדי להעביר חמישה עד שבעה מיליליטרים נוספים של מצע תרבית דרך המסננת אל תוך צלחת הפטרי.
כדי לאסוף את שארית העיןולטים (eyelets) מהמסנן תחת עדשה פי 4, בחרו את העיןולטים בבודד באמצעות פפית P 200 והעבירו אותם לנבובת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. תמונות אלו מציגות עיןולטים שבודדו מעכברי C 57 black six בני 12 שבועות. ניתן להעריך את טהרות ואיכות העיןולטים באופן מיקרוסקופי עם השלמת הליך הבידוד.
לדוגמה, שתי התמונות המוצגות כאן מראות שדה מייצג שבו קיימים פסולת וזיהום של תאים אקסוקריניים. בעת בחירת עיניות (eyelets) לניסוי, הימנעו מבחירת תאים אקסוקריניים מזוהמים או עיניות שנראות לא בריאות. עיניות עם מרכזים נמקרוטיים אינן בריאות, כפי שמוצג בדמות זו שצולמה 24 שעות לאחר הבידוד; מרכזים נמקרוטיים לא יהיו נראים מיד לאחר הבידוד.
תאי עינית (eyelets) השואבים תאים הם בלתי נמנעים וניתנים לשימוש בהשתלת עיניות, כפי שניתן לראות בסרטון time lapse זה של 24 שעות של עיניות. מיד לאחר הבידוד, מתפתחים מרכזים נמקריים בתוך רבות מהעיניות. נראה כי מרכזים נמקריים אלו נדחפים החוצה מהעינית לקראת סוף ההקלטה בעת בחירת העיניות.
קבצו אותם כך שבכל מבחנה יהיה פיזור שווה של איכות וגודל הלולאות. לדוגמה, כל קבוצה של 15 לולאות עשויה להכיל ארבע לולאות בגודל גדול, שש לולאות בגודל בינוני וחמש לולאות בגודל קטן. הניחו את המבחנה על קרח. ניתן להשתמש בלולאות מיד להשתלה או לעבד אותן.
לפני השימוש, הכניסו טיפ סטרילי לטעינת ג'ל לתוך הפתח של מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 מיליליטר, כך שייווצר כיפוף עדין בצורת U בקצה הצר של הטיפ. שני פתחי הטיפ צריכים לפנות ישירות כלפי מעלה מחוץ למבחנה המיקרו-צנטריפוגית.
הוציאו בעדינות מבחנה של eyelets מהקרח. ודאו שכל ה-eyelets שקעו לתחתית המבחנה. בעזרת פיפט P 200, אספו בעדינות את ה-eyelets בנפח מינימלי מתחתית המבחנה והעבירו אותם לטיפ העקומם שהוכן.
לאחר שאי כריות הבטא שקעו, הסירו כמה שיותר מהמדיום מקצה הטיפ על ידי שאיבת המדיום דרך הפתח הגדול של טיפ טעינת הג'ל הנושא את כריות הבטא, באמצעות טיפ טעינת ג'ל חדש המחובר לפפיט P 200. חברו את הקצה שאינו משופע של הפרוטור לפתח הצר של טיפ טעינת הג'ל הנושא את כריות הבטא. לאחר מכן, חברו את הטיפ לפפיט P 200 ודחפו בעדינות את כריות הבטא אל תוך הפרוטור.
בשלב הבא, חברו את הקצה שאינו משופע של צינור ה-PE 50 למחט של מזרק Hamilton בנפח 25 microliter. כאשר הבוכנה נסוגה, לחצו על בוכנת המזרק עד שהעיניות נמצאות במרחק של כ-0.5 centimeters מהפתח המשופע. הניחו את המזרק בצד כדי שהעיניות יוכלו להצטופף למסה אחת ליד הפתח המשופע של הצינור, בזמן שהכליה מוכנה לקבלת העיניות.
הכינו את אזור הניתוח על ידי גילוח שיער וקרצוף העור עם Betadine לסירוגין עם 70% isopropyl alcohol שלוש פעמים. התחילו את הליך השתלת ה-eyelet על ידי ביצוע צביטה של הבוהן כדי לוודא הרדמה בעכבר המקבל. מקמו את מוט זכוכית ישירות מתחת לעכבר, מתחת לכליה ובזווית ניצבת לעמוד השדרה.
לאחר מכן, אתרו את הכליה דרך העור והניחו סביב חיתוי כירורגי סטרילי. ברגע שמיקום הכליה אותרה, השתמשו במספרי McFerson banis כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים דרך הדרמיס ישירות מעליה, בניצב לעמוד השדרה. חתך זה יחשוף את דופן הפריתוניאום בעזרת המספריים.
בצעו חתך של סנטימטר אחד דרך הדופן הפריטוניאלית באותו כיוון של החתך בשכבת העור, תוך שימוש בגוף מוט הזכוכית כמשענת, והוציאו את הכליה דרך הפתח הפריטוניאלי על ידי לחיצה על המשטח הסמוך. הרטיבו את פני השטח של הכליה החשופה ב-PBS סטרילי קר מאוד (בטמפרטורת קרח) באמצעות מקלוני צמר גפן ספוגים. חזרו על שלב זה מדי כמה דקות לפי הצורך, כדי למנוע את התייבשות קפסולת הכליה.
באמצעות מחט בכיול 27 gauge, בצעו חתך של 0.2 סנטימטר דרך קפסולת הכליה על פני השטח הקדמיים של הכליה. החלו מהצד הלטרלי השמאלי לכיוון הצד הלטרלי הימני, והחדירו צינור נימי מזכוכית שנמשך בלהבה. חקרו דרך החתך שבוצע קודם לכן והזיזו אותו לכיוון אחורי לאורך השטח הלטרלי הגבי של הכליה.
כדי ליצור כיס בין קפסולת הכליה לפרנכימה של הכליה, העבירו את פתחי היציאה במזרק המילמטר של Hamilton בנפח 25 מיליליטר לקצה הפתוח של הפיה האלכסונית של הפחית הגמישה. לאחר מכן, הכניסו את הקצה האלכסוני כאשר הוא פונה כלפי מעלה אל תוך הכיס התת-קפסולרי. הקצה הארוך נמצא במגע עם פרנכימת הכליה.
העבירו את השפופרת לקצה האחורי ביותר של הקפסולה. לאחר מכן, העבירו באיטיות את הלולאות משפופרת ה-PE 50 אל תוך השקיק התת-קפסולרי על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. ככל שהלולאות ממלאות את השקיק, משכו לאט את השפופרת הגמישה החוצה כדי לפנות מקום נוסף.
לאחר הוצאת המבחנה מהכיס, החלק את גשושית הזכוכית לאורך פני השטח החיצוניים של הכליה, מכיוון קדמי לאחורי, כדי לדחוס בעדינות את הלולאות לקצה הפרוקסימלי של הכיס. באמצעות פינצטה זוויתית, הרם את ריפוד הפריטונאום הסמוך לפתח שנוצר עבור הכליה. לאחר מכן, השתמש במקלון צמר ספוג ב-PBS כדי לדחוף בעדינות את הכליה חזרה אל חלל הפריטונאום.
סגרו את העכבר על ידי החלת תפרים בדופן הפריטונאום וסגירת שכבת העור באמצעות סיכות (wound clips). החזירו את העכבר לכלובו ועקבו אחריו. לצורך ההחלמה, יש לספק לעכבר מים עם aceto meine למען מערכת העיכול.
בודדו עיניות עכבר C. תוך שימוש בשיטות המתוארות בסרטון זה, הועבר מינון ריפוי לתוך עכברי C 57 black six אלוגניים. רמות גלוקוז בדם במצב לא צום נוטרו החל מהיום הראשון לאחר הניתוח.
דחייה צפויה להופיע סביב היום ה-17 בעכברי מקבל ששוקלם 20 גרם שקיבלו 300 eyelets מתורם אלוגני כאן. ההחלמה נוטרה בעכברים שקיבלו 150 eyelets או 300 eyelets מתורמים סינגניים. לא נצפתה דחייה בהשתלות אלו כיוון שה-eyelets הגיעו מתורמים סינגניים.
מינון האיליטים שניתן מודד את התפקוד הראשוני של האיליטים מיד לאחר השתלה. בעוד שעם 150 איליטים נצפתה התאוששות חלקית, השתלה של 300 איליטים הובילה להתאוששות מלאה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לבצע את השלבים הקריטיים הנדרשים לבידוד איליטים של עכבר ולהשתלתם במרווח התת-קפסולרי של הכליה.
עם התמדה, תפתחו את היכולת לבצע קנולציה מהירה של תעלת המרה המשותפת, שמהווה את השלב המאתגר ביותר בפרוטוקול זה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לבידוד איים לנגריק מהלבלב של עכברים ולהשתלתם בחלל התת-קפסולרי של הכליה. מטרת ההשתלה היא לבחון טיפולים פוטנציאליים לסוכרת מסוג 1.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של השתלה
- מחקר סוכרת
- בידוד תאי איים
רקע
- השתלת איים היא טיפול מוצע לסוכרת מסוג 1.
- האתגרים כוללים את הצורך במספר רב של איים ובדיכוי חיסוני לכל cuộc החיים.
- שיפור תוצאות ההשתלה הוא קריטי עבור יישום קליני.
- מודלים של עכברים משמשים לחקר טכניקות השתלה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד ולהשתלה של איים של לבלב.
- הערכת התפקוד של איים מושתלים בעכברים סוכרתיים.
- הדגמה של הטכניקות הכירורגיות המעורבות בהליך.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד איים מבלוטות לבלב של עכברים באמצעות עיכול אנזימטי.
- השתלה של איים לחלל התת-קפסולרי של הכליה.
- ניטור רמות הגלוקוז בדם בעכברים מקבלים להערכת תפקוד השתל.
- טכניקות כירורגיות מפורטות לקינולציה של תעלת המרה ובידוד הלבלב.
תוצאות עיקריות
- כ-250 עד 350 איים יכולים להחזיר נורמוגליקמיה בעכבר מקבל במשקל 20 גרם בתוך 24 שעות.
- הודגמו טכניקות קנולציה מוצלחות עבור גישה לצינור המרה.
- השגה של התאוששות אופטימלית של איים הושגה באמצעות שיטות בידוד ועיבוד קפדניות.
- הודגמו באופן חזותי שלבי הניתוח לצורך בהירות.
מסקנות
- המחקר מתווה שיטה ישימה לבידוד והשתלה של איים לבלב.
- טכניקות משופרות עשויות להגביר את סיכויי ההצלחה של השתלת איים במסגרות קליניות.
- נדרש מחקר נוסף כדי להתמודד עם המגבלות של פרקטיקות ההשתלה הנוכחיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתתלת איים נותרת מוגבלת בשל מחסור בתורמים והנטל של דיכוי חיסוני, דבר המגביל את היכולת להרחבת הטיפול בסוכרת מסוג 1. מודל עכברי זה מאפשר הערכה פרה-קלינית של איכות האיים, קשרי מינון-תגובה ותפקוד הש Transplant תחת תנאים מבוקרים. על ידי סטנדרטיזציה של הבידוד וההשתתלה התת-קפסולרית, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים של טיפולים מבוססי איים לפני מחקרי IND-enabling.
יישומים אסטרטגיים במו and פיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של איים מבודדים על ידי הערכת השחזור של נורמוגליקמיה בנ recipient-ים סוכרתיים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לבחינת היפותזות טיפוליות הקשורות להישרדות ולהשתחלה של איים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדי השתחלה כמותיים באמצעות נורמליזציה של רמות הסוכר בדם, ובכך תומך בניתוח תגובה למינון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת האיים והשתלה שלהם לצורך קבלת תוצאות עקביות בין הקבוצות הניסיוניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה את אתר השתלה קליני (החלל התת-קפסולרי של הכליה) להערכת חיות הש Transplant ואינטראקציות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה בין השתלות סינגניות לאלוגניות לצורך גיבוש אסטרטגיות לדיכוי חיסוני.
שילוב תהליכי עבודה ופייפไลน์
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבידוד איים (זיהוי מוביל) ועד להערכה תפקודית במודלים סוכרתיים (תיקוף פרה-קליני), ובכך היא מאפשרת אופטימיזציה איטרטיבית של פרוטוקולי בידוד וטכניקות השתלה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי איכות וחיוניות האיים באמצעות קריאות של השתחון תפקודי.
- סריקה: מבטיחה מוכנות של הבדיקה באמצעות מדדי תפוקה, טוהר וחיוניות סטנדרטיים של האיים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של תפקוד השתבלโดย שימוש ברמות גלוקוז בדם כנקודת סיום פרמקודינמית.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין טכניקות בידוד לתוצאות פרה-קליניות על ידי מתאם בין מינון האיים לתיקון גליקמי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת אסטרטגיות חדשות להגנה על איים, כמיסה או אימונומודולציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי לגבי פוטנציאל האיליים על ידי קישור איכות הבידוד לתפקוד in vivo.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבים סטנדרטיים של עיכול אנזימטי, טיהור והשתלה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי הגדרת מינון מינימלי יעיל של איליים (250–350) להשגת נורמוגליקמיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים מבוססי-איליים מותאם סיכונים, בהתבסס על יעילות השביעות (engraftment) והעמידות שלהם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים, בניתוח הלבלב ובטכניקות של קניולציה.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מיקרוסקופ לניתוח, מזרקי Hamilton וצנטריפוגה עם סלסלאות נדנודיות.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של פרפוזיה ועיכול כדי למזער זיהום אקסוקריני.
- כולל התאמה בין זני עכברים וקבוצות גיל שונות כדי להבטיח תנובת איים עקבית ואיכותית.
- מוגבל על ידי שונות טכנית בקניולציה של תעלת המרה, המשפיעה ישירות על השחזור והטוהר של האיים.
