הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

על מנת לטהר את חלבון הממברנה Mex B, ראשית מבטאים את Mex B ב-e coli באמצעות שיטות של DNA רקומביננטי. לאחר מכן, מבודדים את הממברנות וממיסים את חלבוני הממברנה בעזרת דטרגנט עדין. חלבון הממברנה המומס מטהר באמצעות iMac, והחלבון מטהר בהמשך באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל.

רמת טיהור החלבון נקבעת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS poly ACRYLAMIDE. למרות שנוהל זה יכול לספק תובנות לגבי נשאי קרום חוצצים בעמידות לרב-תרופות, ניתן להחילו אותו גם על חלבוני קרום אחרים. את הפרוצדורות כיום יבצע סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לצורך נוהל זה, Mex B מ-pseudomonas Aosa ישכפל לתוך וקטור הביטוי PET 30 B plus, כך ש-Mex B יתבטא עם תג HEXA histamine בקצה ה-C. התחילו בערב על ידי הזרקה של ארבעה תרבימי lb can mycin בנפח 3 mL עם טרנספורמנטים טריים או השתמשו במאגר קפוא, וגדלו את התרבימים על גלגלת בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.

השתמשו בתרביות הלילה כדי להחדיר ל-150 מיליליטר של LB המכיל 30 מיקרוגרם למילליטר קאנמיצין (Kanamycin). גדלו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס על ניער אחר הצהריים. השתמשו בתרבית הקטנה כדי להחדיר לשש בקבוקים של ליטר אחד של מצע XYT המכיל 30 מיקרוגרם למילליטר.

האם ניתן להוסיף מייסין לבקבוקי ערבול של שרך? השתמש ב-25 milliliters לכל תרבית עבור דילול של 1 ל-40. גדל את התרביות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד שיגיעו לצפיפות אופטית.

600 של 0.4 עד 0.6, כ-1.5 שעות. כאשר התרביות מגיעות לצפיפות המתאימה, השרו ביטוי של החלבון על ידי הוספה של 0.5 מיליליטר של IPTG בריכוז one molar. החזירו את כל הבקבוקים למכשיר הניעור והמשיכו לגדל אותם ב-30 degrees Celsius למשך הלילה עד לקצירת החיידקים למחרת בבוקר.

הוציאו את התרביות מהמנער וקררו אותן. לאחר מכן, כדי לקצור את התאים, העבירו את התרביות למבחנות צנטריפוגה ובצעו סבב צנטריפוגה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במהירות של 5,000 סל"ד בצנטריפוגה רחבה. בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה, הוסיפו למספר 100 milliliters של בופר לריסספנסיה של תאים מעכבי פרוטאז של DNAs וליזוצים.

בנוסף, יש להוסיף מעכבי פרוטאז לשתי מנות של תמיסת membrane Resus suspension Buffer כפי שמוצג בטבלה זו. יש לשמור את שלושת התמיסות על קרח עם סיום הסבוב במערכת הצנטריפוגה. יש לבצע רספנסיה (Resus) של משקעי התאים ב-100 milliliters של תמיסת cell resus suspension Buffer.

בשלב הבא, בצעו את מיצוי התאים. תרחיף התאים נטען לתא הלחץ של ה-French pressure cell, והתא מונח על ה-French press. הלחץ מופעל עד להגעה ל-12,000 pounds per square inch.

פותחים את השסתום באופן חלקי מאוד כך שהתאים השבורים יזלגו החוצה. חשוב לא לפתוח את השסתום יותר מדי ולא לאפשר לתאים להישפך בעוצמה, כיוון שבמקרה כזה הם ישתחררו בלחץ נמוך מדי ולא יישברו ביעילות. אוספים את הליזט התאי לבקבוק שנשמר קר על קרח.

העבירו את תמיסת התאים שוב דרך תא לחץ של French בלחץ של 12,000 pounds per square inch. העבירו את הליזאט התאי למבחנות צנטריפוגה מסוג SS 34 ובצעו צנטריפוגה להסרת שיירי תאים ב-10,000 rotations per minute למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius ברוטור SS 34. השלב הבא הוא הליזאט המזוקק.

משמש להכנת פראקציית הממברנה. העבר בזהירות את העלייה (supernatant) למבחנות אולטראסנטריפוגה מסוג ti. 6 4, 7 0.5, וסבב ברוטור TI 6 4 7 0.5 במהירות של 40,000 סיבובים לדקה למשך 50 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

שפוך את הנוזל העליון. השתמש בפיפטה כדי להשעות בעדינות את המשקע, המכיל את ממברנות התאים, בכ-25 milliliters של תמיסת סספנסיה membrane Resus. העבר את תספנסיאת הממברנה למבחנת צנטריפוגה נקייה וסובב שוב ברוטור TI I 6 4 7 0.5 במהירות של 40,000 סיבובים לדקה למשך 50 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, והשעה את משקע הממברנות השטוף ב-25 milliliters של תמיסת סספנסיה membrane Resus. לאחר מכן, המס את חלבוני הממברנה בממברנות שהושעו בכ-25 milliliters.

הוסיפו שישה מיליליטרים של 10% DDM כך שריכוז הדטרגנט הסופי יהיה 2% DDM. נערנו את התערובת בתנועות נדנוד (rock) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר דגירה של שעתיים בנוכחות DDM, סבבנו את התערובת בצנטריפוגה ב-40,000 סל"ד למשך 40 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ברוטור TI I 6 4 7 0.5, וזאת על מנת להפריד את קומפלקסי הדטרגנט-חלבון המסיסים מהחלבונים הבלתי מסיסים. שמרו את הסופרנאט המכיל את קומפלקסי הדטרגנט-חלבון Mex B לצורך שימוש בתהליך הטיהור. ערבבו את הסופרנאט המכיל את קומפלקסי הדטרגנט-חלבון Mex B עם שני מיליליטרים של חרוזי זיקה למתכת (IMAC beads) שהושרתה ב-Resus suspension Buffer. דגרו למשך שעה אחת על גלגלת (roller) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר קישור החלבונים לשרף.

שפכו את התרחיף לתוך גוף של עמודה לזרימה בכבידה והשליכו את הנוזל שעבר דרכה. שטפו את העמודה עם 20 milliliters או 10 נפחי עמודה של תמיסת קישור ושטיפה עבור iMac, עד להשלמת שטיפת העמודה. אלוטו את החלבונים הקשורים באמצעות 10 milliliters של תמיסת אלוציה עבור iMac.

קח דגימות של 10 µL מכל פרקציית אלואציה. ערבב עם 10 µL של באפר דגימה SDS בריכוז פי 2, ובצע אנליזה על ג'ל SDS פולי-אקרילמיד בריכוז 10%.

העריכו את הכמות ואת רמת הטוהר של mex B בכל פракציה. שלפו את הפראקציות המכילות את קומפלקסי הדטרגנט של חלבון ה-Mex B ורכזו אותן במרכז spin concentrator בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. היזהרו שחלבון לא ישקער בשלב זה.

בצע מספר סבבי סבוב (spin) קצרים ועקוב אחר היווצרות משקעים. לאחר כל סבב, המשך לטיהור השברים המאוחדים באמצעות עמודת סינון ג'ל. בצע שיווי משקל מוקדם לעמודת Superose 12 HL 30 10/300 עם 24 milliliters של בופר ריצה והמתן לקבלת קו בסיס יציב.

לאחר מכן, שטפו את לולאת הטעינה של מערכת המזרקים (actor system) עם בופר זורם. לפני יישום החלבון על העמודה, סננו את תמיסת החלבון באמצעות מסנן מזרק. לאחר מכן, טענו לעמודה עד 240 µL של תמיסת חלבון, בריכוז של עד 5 mg/mL.

העבירו 1.5 נפחי עמודה של בופר ואספו פראקציות של 0.25 מיליליטר. קומפלקסי דטרגנט-חלבון XB נשטפים כשיא בנפח אלוציה של כ-10 עד 15 מיליליטר. קחו דגימות של חמישה מיקרוליטר מהפראקציות בשיא.

ערבבו כל דגימה ביחס של אחד לאחד עם בופר דגימות SDS בריכוז פי שניים. נתחו את הדגימות על ג'ל poly acrylamide בריכוז 10% כדי להעריך את הכמות והטוהר של me Mex B בכל פרקציה, ובידלו את הפרקציות המכילות ME B טהור. ג'ל poly acrylamide זה נטען עם פרקציות שבודלו מעמודת ה-iMac ופרקציות בודדות מעמודת סינון הג'ל. לאחר עמודת סינון הג'ל, החלבון מופיע כטהור על ג'ל poly acrylamide שנצבע ב-kumasi.

עקבה מעמודת סינון ג'ל מראה את השיא המרכזי של קומפלקס החלבון-דטרגנט הנשטף מהעמודה. התפוקה הממוצעת של חלבון mxb היא כ-שני מיליגרמים לכל שישה ליטרים של תרבית two XYT. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בשמונה שעות אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מבטאים, ממיסים ומטהרים חלבון ממברנה.