ויזואליזציה של שכפול ה-DNA מיטוכונדריאלי של תאים בודדים על ידי הגברה אות Edu
15 בנובמבר 2010
פיתחנו טכניקה רגישה תווית הדנ"א המיטוכונדרי מסונתז החדש (mtDNA) בתוך תאים בודדים כדי ללמוד biogenesis mtDNA. הטכניקה משלבת שילוב של Edu יחד עם פרוטוקול tyramide הגברה (TSA) אות לדמיין שכפול mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לסמן ולהדגים ויזואלית שכיפול של M-T-D-N-A בנוירונים בתרבית. הדבר מושג תחילה על ידי דגירה של הנוירונים עם האנלוג של תימידין EDU למשך שעתיים עד 24 שעות. השלב השני של ההליך הוא סימון ה-EDU, המכיל אלקין, באמצעות הצבע הפלואורסצנטי Oregon Green 488 azide בתגובה קוולנטית המזורזת על ידי נחושת.
השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הגברת אות ה-orgon green באמצעות שלב הגברת אות של aramide, וזאת כדי להנכיח את ה-EDU שנשלב ב-MT DNA שסונתזו מחדש. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שכפול של MT DNA בתאים תת-תאיים ספציפיים של נוירונים, באמצעות שילוב של כימיית clicka EDU והגברת אות tear mind עוקבת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון BRDU, הוא שסימון EDU הוא פשוט יותר ועדין יותר, מה שמאפשר צביעה אימונופלורסצנטית נוספת של סממנים נוירונליים.
שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בוויסות מספר המיטוכונדריה, כגון האופן שבו נוירונים נĐápים לעומסי אנרגיה משתנים במדורי התא השונים, כולל גופי התא, אקסונים, דנדריטים וטרמינלים סינפטיים. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות מרובות המבוססות על מיטוכונדריה, כולל נוירופתיה וניוון עצבי. אך חשוב לציין, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות שבהן שינויים במספר עותקי ה-DNA המיטוכונדרי עשויים להוות את הבסיס לפתוגנזה של מצב מחלה, כולל רעילות לתרופות, סרטן והזדקנות.
סרטון זה ידגים כיצד לסמן DNA מיטוכונדריאלי שסונטז לאחרונה, המכונה M-T-D-N-A, בנוירונים של גנגליון השורש האחורי שגודלו על לוחות כיסוי מזכוכית סטריליים בקוטר 12 מילימטר. בצלחת תרבית בעלת 24 בארות, יש לדלל את תמיסת המלאי בריכוז 10 מילימולר של 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, המכונה EDU, מתוך ערכת הבדיקה Clicka EDO Microplate, ביחס של 1:100 בתווך תרבית כדי להכין תמיסת מלאי של 10X EDU. את תמיסת המלאי 10X EDU מוסיפים ישירות לתווך בכל בארה. יש לדגרה את הנוירונים המטופלים למשך 2 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide בתוך מנדף כימיים.
קבע את הנוירונים ב-2% Paraform aldehyde למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף פעמיים ב-one XPBS למשך שתיים עד חמש דקות בכל שטיפה. ניתן לשמור את הנוירונים המקובעים ב-one XPBS טרי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
הכינו תא לחות כפי שמתואר בטקסט הנלווה. השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק כדי להעביר 28 לביבות כיסוי מקובעות, כולל בקרות EDU חיוביות ושליליות, לדפי paraform M הידרופוביים בתוך תא הלחות. הוסיפו שוב 200 עד 300 µL של XPBS כדי לכסות את פני השטח של כל לביבת כיסוי.
הכינו את ערכת ה-click it כפי שמתואר בטקסט ובהוראות היצרן, כדי לסמן DNA מיטוכונדריאלי באמצעות 75 עד 80 µL של תמיסה חדירה המכילה 0.1% tritton X ב-1XPBS לכל זכוכית כיסוי, והדגריו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השתמשו בפיפט עם נורה וטיפ של 200 µL המחובר לקצה, כדי להסיר בעדינות את הנוזל ללא אובדן תאים.
השתמשו בפיפט עם נורית כדי להציף בעדינות את הזכוכית. העבירו 200 עד 300 µL של XPBS כדי לשטוף ביסודיות את התמיסה הקודמת. שטפו כל זכוכית פעמיים.
טפטף 75 עד 80 µL של מי-חמצן 1% טריים ב-one XPBS על כל לבישת זכוכית (cover slip). דגור במצב מכוסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל פעילות פראוקסידאז אנדוגנית. שטוף פעמיים עם one XPBS כפי שנעשה קודם, והכן באופן מיידי את תמיסת ה-click reaction כפי שפורט בטקסט הנלווה.
העבירו את הנוזל למעלה ולמטה באמצעות פיפטה כדי לערבב. אין להשתמש במערבל וורטקס. בצעו קיבוע משלים (postfix) לנוירונים עם 75 עד 80 µL של מחליט Click-iT EDU לכל זכוכית כיסוי; דגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. במהלך דגירת הקיבוע המשליים, דללו את תערובת התגובה בנפח שווה של מחליט Click-iT EDU.
הוסיפו את תג 혼לורת התגובה לכל כיסוי של זכוכית כיסוי כדי להגן מאור, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. הסירו בעדינות את תערובת התגובה ושטפו פעמיים עם בופר חסימה (blocking buffer) בדילול 1x תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי. בדקו אם קיימת צביעת Orgon Green בגרעינים עם השלמת צביעת ה-EDU.
התחילו את הגברת האות בשיטת TSA על ידי הוספת 1% TSA block solution לכל כיסוי זכוכית (cover slip) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. סובבו קצרות את מלאי הנוגדן ה-anti-nuclear green horse radish peroxidase conjugated, שהוכן 2 עד 24 שעות לפני ה-TSA. דללו את הנוגדן הראשוני ביחס של 1:300 ב-TSA blocking solution וערבבו על ידי הפיכה או פיפטור, ללא שימוש ב-vortex. הוסיפו 75 µL לכל כיסוי זכוכית ודגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.
ביום למחרת, שטפו שלוש פעמים עם XPBS בטמפרטורת החדר. הדגרימו את כיסויי הזכוכית (cover slips) בשטיפה האחרונה למשך 30 עד 60 דקות נוספות כדי להבטיח שנוגדן ראשוני שאינו קשור יוסר. הכינו את תגובת ה-IDE בהתאם לחלק הטקסטואלי של פרוטוקול זה מיד לפני השימוש.
דגרו את כיסויי הזכוכית עם תגובת ה-IDE למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו שלוש פעמים עם XPBS אחד, תוך דגירה בשטיפה האחרונה למשך 30 עד 60 דקות כפי שבוצע קודם לכן תחת המיקרוסקופ. בדקו את סימון ה-MT DNA, והעבירו נוירונים שנצבעו בהצלחה לשקופיות זכוכית באמצעות מדיום עיגון ANTIFA המכיל DPI. המוצגות כאן הן תמונות מייצגות בשיטת ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (DIC) של נוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRG) עובריים ובוגרים, המשמשים בדרך כלל לצורך ניתוח.
דיאגרמות סכמטיות אלו מייצגות את ההליך לסימון EDU ב-MTD NA באמצעות אות פלואורסצנציה ירוק. תאי נוירובלסטומה F 11 פעילים מיטוטית משמשים כביקורת חיובית וממחישים את דפוס הסימון של EDU שנטמע ב-DNA גרעיני וב-DNA מיטוכונדריאלי בתמונות פלואורסצנציה מייצגות אלו, המוטלות על גבי שדה בהיר. האותות הנקודתיים הירוקים מראים את אות ה-EDU המוגבר שנטמע ב-M-D-D-N-A שסונתז לאחרונה בתומי נוירונים של גנגליון השורש האחורי, הן עובריים והן בוגרים.
פרוצדורת הסימון ב-EDU מאפשרת צביעה אימונופלואורסצנטית עוקבת של סממנים נוירונליים כגון נוירופילמנט באדום. תרשימים סכמטיים אלו מייצגים את הפרוצדורה לסימון EDU ו-MTD NA באות פלואורסצנטי אדום. תאי נוירובלסטומה F 11 פעילים מבחינה מיטוטית משמשים כביקורת חיובית ומדגימים את דפוס הסימון של EDU שנשלב ב-DNA גרעיני וב-DNA מיטוכונדריאלי.
תרשים זה מייצג את ההליך לסימון BRDU ב-M-T-D-N-A שסונתז לאחרונה באמצעות אות פלואורסצנטי ירוק או אדום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להריץ בקרות באמצעות תאים פעילים מיטוטית על מנת לוודא סימון EDU מוצלח וזיהוי גרעיני תאים לפני המעבר לשלבי ההגברה להצגת סימון MT DNA בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונופלואורסצנציה סטנדרטית, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו מווסת סינתזת DNA מיטוכונדריאלית בתתי-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים או במקטעים נוירונליים. הודות לפיתחו, יסלול טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את הוויסות של מספר המיטוכונדריה במודלים של תרבית המדמים הן פיזיולוגיה תקינה והן מחלות עם ליקויים.
מצבים נוירולוגיים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה חדשנית לסימון DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) שסנתז לאחרונה בנוירונים בתרבית, המאפשרת ויזואליזציה של שעתוק mtDNA. השיטה משלבת שילוב של EdU עם הגברה של אות טיראמיד (tyramide signal amplification) כדי לספק תובנות לגבי הביוגנזה של mtDNA בתוך תאים תת-סלולריים נוירונליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- ביולוגיה של התא
רקע
- DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) ממלא תפקיד מכריע במטבוליזם האנרגיה התאי.
- הבנת השכפול של mtDNA חיונית לחקר התפקוד והבריאות של נוירונים.
- לשיטות סימון קיימות, כגון BRDU, יש מגבלות שטכניקה חדשה זו נותנת להם מענה.
- ניתן להחיל שיטה זו על תנאים שונים הקשורים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה רגישה להדמיה של רפליקציית mtDNA בנוירונים.
- בחינת הוויסות של מספר המיטוכונדריות בתגובה לדרישות אנרגיה.
- מתן תובנות לגבי הפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות הקשורות למיטוכונדריה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגיינונים של נוירונים עם EdU למשך 2 עד 24 שעות.
- EdU מסומן באזיד פלואורסצנטי באמצעות תגובה המזורזת על ידי נחושת.
- הגברה של אות באמצעות טירמיד (Tyramide signal amplification) משמשת לשיפור האות הפלואורסצנטי.
- ביצוע צביעה אימונופלוורסצנטית להדגמה של סממנים נוירונליים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מסמנת בהצלחה mtDNA במדורים עצביים ספציפיים.
- התוצאות מדגימות את היכולת להדמיות של דינמיקת השכפול של mtDNA.
- היא מאפשרת צביעה אימונופלואורסצנטית נוספת של סממנים עצביים.
- הממצאים תורמים להבנת ההתנהגות המיטוכונדריאלית תחת עומסי אנרגיה משתנים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה נגישה יותר לחקר רפליקציית mtDNA.
- יש לה יישומים פוטנציאליים בהבנת מחלות נוירולוגיות שונות.
- ניתן להתאים את הטכניקה למחקר של מצבים פתולוגיים אחרים הקשורים לתפקוד מיטוכונדריאלי לקוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המנהלים
טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה רגישה של שעתוק ה-DNA המיטוכונדריאלי בתאים בודדים, ומספקת מדד כמותי לביוגנזה מיטוכונדריאלית. היא תומכת בתיקוף מטרות במודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים ומחלות מטבוליות על ידי קישור הדינמיקה של mtDNA לדרישות האנרגיה התאיות. השיטה משפרת את הביטחון החזוי בסינון פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה עם סמנים נוירונליים ומחקרי לוקליזציה תת-תאית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לוויסות ביוגנזה מיטוכונדריאלית.
- ערך תפעולי: מספק גישה עדינה יותר לסימון, התואמת לצביעה אימונוהיסטוכימית מרובת סמנים (multiplex immunostaining) לצורך ניתוח מסלולים.
- ערך ניבואי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קורלציה בין סינתזת mtDNA לבין פעילות נוירונלית ועומס אנרגטי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר אותות פלואורסצנטיים נקודתיים וכמותיים המתאימים לפלטפורמות של דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging).
- שחזור: הגברה של אות טירמיד (Tyramide signal amplification) מבטיחה זיהוי אות עקבי בין חזרות ניסיוניות.
- ניתנות להרחבה: תואם לפורמטים של פלטות רב-בארים (multi-well plate) ולתהליכי עבודה של מיקרוסקופיה אוטומטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למודלים של נוירופתיה, ניוון עצבי, רעילות לתרופות, סרטן והזדקנות, שבהם שינויים במספר העותקים של mtDNA הם פתוגניים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של התערבויות המכוונות למיטוכונדריה.
- הפחתת סיכונים: מאפשר הפחתת סיכונים מוקדמת של תרכובות המשפיעות על התפקוד המיטוכונדריאלי על ידי ניטור השפעות הביוגנזה על המטרה (on-target).
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization), במיוחד עבור מודולטורים מיטוכונדריאליים. היא תומכת בתיקוף פגיעות (hit validation) על ידי אישור מעורבות במטרה (on-target engagement) באמצעות סינתזת mtDNA במדורים תת-תאיים רלוונטיים. התוצר הכמותי מסייע בתעדוף תרכובות בעלות פרופילי בטיחות מיטוכונדריאליים נוחים.
- ביולוגיה של גילוי: בודק השערות על ויסות מיטוכונדריאלי בתגובה למטען מטבולי או להפעלה עצבית.
- סינון (Screening): מספק קריאות פלואורסצנציה סטנדרטיות ומוגברות המאפשרות לנקב שינויים בשכפול mtDNA המושרים על ידי תרכובות.
- אנליטיקה: מספק נתוני מרחב ועוצמה התומכים בניתוח השוואתי בין תנאי טיפול ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro לבין תפקוד מיטוכונדריאלי לקה הרלוונטי למחלה שנצפה במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת פגיעה מיטוכונדריאלית בתוכניות טיפוליות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במעורבות המטרה (target engagement) על ידי ויזואליזציה של השפעות ישירות של מודולציית מסלולים על סינתזת mtDNA.
- ערך תפעולי: מבטל שלבי דנטורציה חריפים הנדרשים עבור BrdU, ובכך משמר את האנטיגניות לצביעה בו-זמנית של סמני נוירונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכת הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות בהערכת בטיחות מיטוכונדריאלית.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על הקצאת משאבים מותאמת סיכונים עבור תרכובות בעלות מנגנונים מיטוכונדריאליים מאושרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיית קליק (click chemistry), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וטכניקות של תרבית נוירונים.
- תלוי בגישה ל-EdU, אזידים פלואורסצנטיים, מימן פראוקסיד וריאגנטים להגברת אות טיראמיד (tyramide signal amplification).
- מחייב פרוטוקולי קיבוע וחדירות (permeabilization) סטנדרטיים כדי להבטיח נגישות עקבית ל-EdU.
- יש להביא בחשבון זמני אינקובציה משתנים (2–24 שעות) בהתאם לסוג התא ולקצב השכפול.
- מוגבל לזיהוי סינתזה של mtDNA ראשוני; אינו מדווח על מספר העתקים כולל של mtDNA או על קצבי פירוק.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:58
Introduction
1:56
Preparation of Neurons
3:38
Click-iT 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) Labeling
5:31
Tyramide Signal Amplification (TSA) of EdU Signal
7:09
Visualization of Mitochondrial DNA Replication as a Marker for Mitochondiral Biogenesis
8:37
Conclusion
