הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית

היפופיזיטיס אוטואימונית מאופיינת בהגדלה של בלוטת יותרת המוח ובחסור בהורמון אחד או יותר מבלוטה זו. האוטו-אנטיגנים הגורמים למחלה נותרו לא ידועים. כאן מוצג פרוטוקול להכנת חלבונים מבלוטת יותרת המוח של עכבר לצורך חקר מחלה זו.

ראשית, מבודדים בלוטות פיתואיטריז מעכברים שהורגזו. לאחר מכן, מבצעים הומוגניזציה של הבלוטות על מנת לשבור את התאים באופן מכני ולשחרר חלבונים ציטוסוליים. את ההומוגנאט מבהירים באמצעות צנטריפוגציה במהירות נמוכה, ואת הכמות והאיכות בוחנים באמצעות בדיקת BCA קולורימטרית וכרומטוגרפיית ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE).

לבסוף, את הומוגנאט החלבון המימי מערבבים עם אדג'ובנט שומני. תערובת זו מוזרקת לאחר מכן לעכברים כדי ליצור מודל עכברים המדמה היפופיזיטיס אוטואימונית. כפי שמוצג בסרטון הנלווה, תוארו ארבע טכניקות להשראת היפופיזיטיס בבעלי חיים ניסיוניים.

הטכניקה המוצגת במאמר זה, שהיא הזרקה של תערובת חלבונים מהיתבון כעזר שפעת, היא הוותיקה ביותר ומתאריכה לשנות ה-60. גישות אחרות כללו הזרקה של גליקופרוטאינים מסיחים מנגיף האדומים בשנת 1992, הזרקה סטריאוטקסטית של אדנווירוס ישירות לבלוטת היתבון בשנת 2002, והשתלה של בלוטת יתבון מזן חולדה אחד תחת הקפסולה של הכליה של זן חולדה אחר בשנת 2010. היתרון המרכזי של גישת העזר של Florence הוא שהיא פחות פולשנית כיום, עקבית יותר ובעיקר מדויקת יותר בהשראת מחלה הדומית מאוד למקבילה האנושית.

למרות שדווחה כבר משנות ה-60, טכניקת האדג'ובנט הזר (foreign adjuvant) הניבה תוצאות דלות בהשראה של היפופיזיטיס (hypophysitis). בתחילת עבודת הדוקטורט שלי, הצלחתי להשיג מקרים של היפופיזיטיס בחומרה מתונה בלבד תוך שימוש בפרוטוקול האדג'ובנט הזר שפורסם. המצב השתפר משמעותית כאשר עלה לי הרעיון להגדיל פי עשרה את כמות חלבוני הפיתואיטרי (pitu proteins) המצויים בתוך תחליב ה-EM.

למרות ששיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי הפתוגנזה של היפופיזיטיס אוטואימונית, ניתן להשתמש בהן גם כדי לחקור מחלות אוטואימוניות אחרות שבהן האוטו-אנטיגנים טרם זוהו. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטות אלו יתקשו בעיקר בשלב האחרון, הכנת השוליים (margin), כיוון ששלב זה דורש מיומנויות ידניות, זמן ומסירות. לכן, הדגמה חזותית היא קריטית כדי להבין כיצד יש להכין אמולסיה תקינה.

ההשלכות של טכניקה זו חורגות מתחום autoimmune. הידע כיצד להכין את האנטיגן לחיסון יכול לשמש גם לייצור של נוגדנים מונוקלונליים או לבדיקת חיסונים חדשים. טכניקה זו תודגם על ידי S Zoo heroic Ura ו-Mayland al gato מהמעבדה שלי.

הבלוטה הפיתואיטררית (בלוטת יותרת המוח) של העכבר היא בלוטה בעלת צורה גלילית השוכנת בבסיס הגולגולת, בשקע בעצם הספנואיד הנקרא la tursica. הבלוטה גבולה מצדדים על ידי עצבי השלישייה ומקדמה על ידי הצלב האופטי (optic nerve chiasm). היא מורכבת מאונה קדמית גדולה יותר, ומאונונים ביניים ואחוריים קטנים יותר.

לבידוד בלוטת הפיטואיטרי, השתמש במספריים כדי לערוף את ראשו של העכבר שהורג, ולאחר מכן בצע חתכים מקבילים מהחלק האחורי לקדמת הגולגולת. הרם את המוח והפוך אותו לאחור כדי לחשוף את בלוטת הפיטואיטרי, הנראית כגליל בתוך משולש ששווה שוקיים, כאשר בלוטת הפיטואיטרי מהווה את הבסיס, העצבים הטריגמינליים מהווים את השוקיים והכיאזמה האופטית מהווה את קודקוד המשולש.

הקיפו את בלוטת האצטרבל עם קצותיהן של פינצטה סגורה כדי לקרוע את הקרומי העוטפים. לאחר מכן, בעזרת פינצטה עדינה, תפסו את בלוטת ההיפופיזה מהסלה הטורקית (sella turcica) והניחו אותה בשפופרת פלסטיק על קרח יבש. עבור הכנה אחת, אספו 300 בלוטות היפופיזה מעכברים.

איסוף זה דורש כמעט תשע שעות עבודה. ברגע שהאיסוף הושלם, יש לאחסן את בלוטות הפיטואיטריה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בהן. יש להניח מבחנה מסוג Falcon בנפח 15 מיליליטר באמבט קרח.

הוסיפו למבחנה 250 µL של חוצץ הומוגניזציה. עבור כל 100 בלוטות פיתואיטרה שנאספו רגע לפני ההומוגניזציה, הוסיפו את בלוטות הפיתואיטרה של העכבר אל החוצץ. לאחר מכן, מקמו את קצה ההומוגניזר מסוג polytron, בעל גנרטור בקוטר 5 mm, בתחתית מבחנת הפאלקון המכילה את בלוטות הפיתואיטרה של העכבר ואת החוצץ, ובצעו הומוגניזציה במהירות מרבית למשך 30 שניות.

הזז את המבחנה בעדינות למעלה ולמטה תוך שמירה עליה על קרח. לאחר מכן, השאר את ההומוגנאט על קרח למשך דקה אחת. חזור על שלבי ההומוגניזציה והקירור פעמיים נוספות.

הומוגניזציה עדינה זו אמורה לפרק את התאים ולשחרר את החלבונים מבלי לשבור את הגרעינים. סבבו במערך צנטריפוגלי את ההומוגנאט במהירות נמוכה, כ-1000 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כדי לשקע את הגרעינים, רקמה שלא פורקה וחומרים בלתי מסיסים כגון רקמת חיבור וקומפלקסים של חלבונים דנטורטיים. יש להקפיד שלא להפריע למשקע.

העבירו את ה-SNA, הנקרא כעת supernatant פוסט-גרעיני או PNS, לשפופרת Falcon חדשה לאחסון. השאירו את ה-PNS על קרח, השביו את המשקע באמצעות אותו נפח של בופר הומוגנציה כפי שנעשה קודם לכן, ובצעו הומוגנציה וסנטריפוגה כפי שבוצעו קודם לכן. לאחר איחוד שתי דגימות ה-PNS, חלקו את התמיסה למספר רב של שפופרות מיקרו-סנטריפוגה.

יש לאחסן את מבחנות המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש. תמיסת חלבון זו יציבה בטמפרטורה של 80°C-, אך מאבדת את יעילותה בהדרגה. לפיכך, מומלץ להשתמש בה בתוך שישה חודשים ממועד ההכנה.

שמרו אליקוטה קטנה אחת של PNS כדי לקבוע את תנובת החלבון ואת ריכוזו באמצעות בדיקת חומצה ביוריאית. לאחר מכן, קבעו את איכות החלבון באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל מ-300 בלוטנות יסתרה של עכברים, שמשקלן הכולל הממוצע הוא כ-570 מיליגרם. צפו לתנובה של 60 מיליגרם של חלבוני היסתרה או מיליגרם אחד של חלבון לכל 10 מיליגרם של רקמה.

ריכוז החלבון הוא בדרך כלל סביב 40 mg/mL. הדוגמה המוצגת כאן היא עבור חיסון של 10 עכברים. התכנון הוא להזריק לכל עכבר 100 µL של אמולסיה המכילה 1 mg של חלבון היפופיזה; כדי לאפשר מרווח של שני עכברים נוספים עבור אובדן חומרים במהלך ההכנה, מוכנים כאן 12 mg של אמולסיית חלבון.

התחל בהפשרה מהירה של מנות החלבון הקפואות על ידי חימומן בכפות הידיים. התאם את ריכוז החלבון ל-20 milligrams per milliliter באמצעות PBS. לאחר מכן, שאב 600 microliters של תמצית חלבון מהפיטואיטרי, המקבילים ל-12 milligrams, לתוך מזרק Gas Tite Hamilton של 2.5 milliliter, ובצע רסוזפנזיה (resuspend) בתוך adjuvant FRONS מלא או CFA המכיל five milligrams per milliliter של mycobacterium tuberculosis שהורג בחום, באמצעות ניעור ידני.

לאחר מכן, שאבו 600 µL של ה-CFA למזרק Hamilton נוסף בנפח 2.5 mL. חברו והדקו מחט מיקרו-אמולסיה בכיול 22 gauge למזרק המלא ב-CFA. דחפו את הבוכנה באיטיות כך שהמחט תתמלא ב-CFA.

לאחר מכן, חברו והדקו את הקצה השני של המחט למזרק השני המלא בתמצית חלבון מהיתנון. הימנעו מלכידת בועות אוויר בתוך המזרקים. דחפו באיטיות את בוכנת מזרק ה-CFA כדי להזרים את רכיב השמן אל תוך תמצית היתנון המימית, כך שרק כמות קטנה תהיה מעורבבת.

לאחר מכן, דחפו את בוכנת המזרק של תמצית היפופיזה לתוך מזרק ה-CFA. חזרו על פעולה זו תוך הגדלה הדרגתית של כמות החומר המעורבב עד לערבוב של כל התוכן. חומר לבנבן זה, המפוזר באופן אחיד, מייצג את אמולסיית המים והשמן.

ברגע שהעירובל (אמולסיה) נוצר, חזרו על מחזור הדחיפה והמשיכה המלא לפחות 500 פעמים. לאחר המחזור האחרון, המזרקים יכילו עירובל של מים ושמן ביחס של אחד לאחד, כאשר ריכוז חלבון היפופיזה הוא כעת 10 milligrams per milliliter. העירובל מוכן לשימוש. כדי לבחון את איכות העירובל, טפטפו טיפה אחת ממנו לתוך כלי כימי עם מים. אם העירובל הוכן כראוי, הטיפה תישאר דחוסה ומגובשת על פני השטח.

אם איכות האמולסיה נמוכה, היא תתפשט ותתפצל לטיפות קטנות יותר. האמולסיה מוזרקת באותו יום של הכנתה לעכברי SJL כדי להשרות היפופיזיטיס אוטואימונית ניסיונית. פרוטוקול זה מפורט ב-jo of vertical הנלווה.

לאחר איסוף בלוטת הפיתואיטריזרי ורכישת מיומנות בטכניקות, ניתן לבצע את הפקת החלבון בשעה אחת, תוך הקפדה על עבודה מהירה ובקרח. במהלך שלב זה, הכנת התמיסה דורשת כשעה אחת. יש לזכור לעבוד באיטיות ובסבלנות בשלב הערבוב הראשוני לאחר הפיתוח.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האוטואימוניות לבחון את המנגנוים שבאמצעותם לימפוציטים אוטוראקטיביים מזהים ומסננים אל תוך איבר המטרה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תמצית חלבון מבלוטתה של עכבר וכיצד לערבב אותה עם Crohn's adjuvant כדי להכין אמולסיה המוכנה לשימוש כאימונוגן. זכרו כי עבודה עם מזרקים ועם Complete Freund's adjuvant, המכיל שחלות מיקרו-בקטריאליות לא פעילות ומייובשות של tuberculosis, עלולה להיות מסוכנת במקרה של דקירה מקרית.

לכן, השתמשו תמיד בכפפות והשליכו מחטים באופן נאות בעת ביצוע פרוצדורה זו.