ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח
21 בדצמבר 2010
אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להמחיש את תוצרי הביניים המבניים של ה-DNA המתרחשים כאשר השכפול נתקל בנגעי DNA, וזאת באמצעות אנליזת ג'ל דו-ממדית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד ה-DNA מתאים המתחלקים באופן פעיל, שבהם הוּשרו נגעים החוסמים את השכפול. לאחר מכן, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל כדי להפריד את ה-DNA שהופק על בסיס גודלו.
בשלב הבא, נגזרים הנתיבים ומוטבעים מחדש באופן אופקי בתוך ג'ל שני, המבצע הפרדה נוספת של ה-DNA על בסיס הגודל והצורה כאחד. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח Southern כדי להדמיאן את מבני ה-DNA הקשורים למקטעי DNA בשכפול, בנקודות זמן לפני ובזמנים שונים לאחר הפעלת נזק המושרה על ידי UV. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהליך זה כדי להראות כי חוסר יכולת לעבד נגעים ב-DNA במוטנטים מסוימים מוביל להצטברות של תוצרי ביניים של תיקון DNA.
שלום, שמי ארתור איאן. אני ממעבדת Corella באוניברסיטת פורטלנד סטייט. שלום, שמי ברנד שי, גם אני ממעבדת Corella.
היום נדגים לכם פרוצדורה של אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור תוצרי ביניים של רפליקציה ותיקון DNA. בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, גדלו תרבית לילה של 200 microliter של e coli המכילה את הפלסמיד PBR 3 22 במצע DGC thigh עם ampicillin בטמפטורה של 37 degrees Celsius. השימוש במצע DGC thigh ממזער את מיסוך ה-UV. לאחר דגירה למשך לילה, השקיעו את התאים ב-14, 000 RRP M למשך 30 שניות.
לאחר מכן, השביה מחדש את משקע התאים ב-200 µL של מצע DG C ללא ampicillin ובצע הזרקה. גדל תרביות ב-20 milliliters של מצע DG C ללא ברירה באמצעות ampicillin, באינקובטור עם ניעור ב-37 °C עד להגעה ל-OD 600 של 0.5, המקביל לכ-5 × 10⁸ תאים למיליליטר. גידול ללא ampicillin מונע ברירה נגד תוצרי ביניים של רפליקציה לא תקינים או לא יעילים שעשויים להיווצר בחלק מהמוטנטים.
בנוסף, במידה ומשתמשים באור UV להשראת נזק, יש להסיר את האמפיסילין מהמצע מכיוון שהוא בולע חזק באורכי גל אלה ומהווה הגנה עבור התאים, ובכך מפחית את מינון ה-UV האפקטיבי בזמן גדילת התאים. השתמשו בפוטומטר UVC כדי לקבוע את המרחק מנורה קוטלת חיידקים של 15 watt המפיקה קצב חשיפה של כ-one JUUL למטר רבוע לשנייה.
יש לבצע את השלבים הבאים תחת תאורה צהובה, שכן הדבר ימנע הפיכה של דימרים של cyclo butane perine על ידי photo liase לאחר הקרנה ב-UV. עם הגעה לצפיפות התאים הרצויה, השתמש בפפית כדי להעביר את התרבית לצלוחית פטרי בקוטר 15 סנטימטר על פלטפורמה מסתובבת, כדי להבטיח הקרנה אחידה של כל אוכלוסיית התאים. לאחר מכן, הקרן את התרביות ב-50 joules per meter squared והעבר אותן מיד לבקבוק סטרילי שחומם מראש, והחזר אותן לדגרה הרוגשת ב-37 degrees Celsius.
במהלך הניסוי, מינון זה מייצר בממוצע דימר אחד של cyclobutane pyrimidine, בכל 4.5 kilobases של DNA גדילי, עבור כל נקודת זמן שיש לבחון. העבירו בפיפטה מנה של 0.75 milliliter מהתרבית לתוך 0.75 milliliters של באפר net 30 קר מאוד. באפר net 30 משמש כבאפר עצירה המונע מהשכפול ומתיקון חיתוך נוקלאוטידים (nucleotide excision repair) להמשיך.
לאחר הוספת באפר העצירה, ניתן לשמור את הדגימה על קרח עד לסיום מסלול הזמן. עם סיום מסלול הזמן, יש לצנטריפוג כל דגימה להשגת משקע ולפתוח מחדש את המשקעים. יש לבצע ליזיס לתאים ב-150 microliters של באפר ליזיס בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 20 דקות ללא ערבוב.
מכיוון שמבנים משוכפלים בעלי אזורי גדיל יחיד או נקודות פיצול רגישים יותר לשבירה, יש לחתוך את קצות התכשירים של הפיפטה בעזרת להב תער כדי להרחיב את הפתח ולמזער את כוחות השבירה. באופן כללי, יש להמעיט בפיפטינג ובערבול עד לאחר עיכול ה-DNA באמצעות אנזימי הגבלה; לאחר הליזיס, יש להוסיף proteinase K ו-sarcas cell ולאפשר לדגירה להימשך שעה אחת. פעולה זו משמשת לשחרור מקטעי DNA הקשורים לחלבון.
מכיוון ש-DNA בשעת שכפול פעיל קשור לעיתים קרובות למתחמי חלבון או ממברנה, דבר זה מסייע להגדיל את תנובת מקטעי השכפול. לאחר שעה, הוצא את הדגימות על ידי הוספת שני נפחים של פנול לכל דגימה והפיכה עדינה של המבחנות במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף שני נפחים של כלורופורם, איזואמיל אלכוהול, והפך בעדינות את המבחנות למשך חמש דקות נוספות.
בשלב הבא, סובב את הדגימות בצנטריפוגת מיקרו במהירות של 14,000 RPM למשך חמש דקות והעבר את הפאזה המימי העליונה של כל דגימה למבחנה נקייה. לאחר מכן, הוסף ארבעה נפחים של תמיסת כלורוכלורול-איסו-אלכוהול, ושוב, הפי את המבחנות בעדינות למשך חמש דקות. סובב את הדגימות פעם נוספת בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך חמש דקות.
הניחו ממbranת דיאליזה מעל 250 milliliters של 0.1 xte בכ كأس, וטפטפו 100 microliters מכל דגימה על גבי הממברנה. הניחו לדגימות לעבור דיאליזה במשך שעה אחת לאחר תחילת התהליך. העבירו 80 microliters מכל דגימה לפ menutup 1.5 milliliter נקי המכיל 20 microliters של תערובת אנזימים.
בצעו עיכול של הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. PV two מקיימת ליניאריזציה של הפלסמיד מיד לאחר מקור השכפול. לפני טעינת ג'ל האגרוז, הוסיפו 100 µL כלורופורם ו-20 µL צבע טעינה בריכוז six x המכיל ברומו.
הוסף Phenol blue ו-xylene cyan לכל דגימה וערבב; כלורופורם יסיר כל PV two שנותר קשור לקצות ה-DNA. התחל בניתוח ג'ל אגרוז דו-ממדי על ידי הרצת דגימות ה-DNA שהגבילו בממד הראשון. ראשית, טען סמן גודל Lambda hind three לנתיב הראשון של ג'ל אגרוז 0.4% שהוכן מראש ב-one XTBE.
לאחר מכן, טענו 40 µL של הפאזה המימית המכילה את צבע הטעינה עבור כל דגימה, תוך השארת נתיבים ריקים כדי להקל על חיתוך הג'ל. לאחר האלקטרופורזה, הריצו את הממד הראשון במתח של וולט אחד לסנטימטר למשך כ-12 עד 15 שעות. המתח הנמוך וריכוז ה-AGROS הנמוך בג'ל משמשים להפרדת מקטעי ה-DNA בעיקר על בסיס גודלם.
לאחר הרצת הממד הראשון, השתמשו בסכין קצבים גדולה כדי לגזור את הנתיב הראשון המכיל את סמן ה-Lambda hind three וצבעו באמצעות atherium bromide. עבור הממד השני, גזרו את נתיבי הג'ל באמצעות סכין הקצבים הגדולה, כאשר סמן ה-Lambda Hind three משמש כנקודת ייחוס; חתכו והשליכו את האזור שמתחת למקום שבו צפוי לרוץ הפלסמיד הליניארי בכל נתיב. כדי ליצוק את הממד השני, הניחו כל פרוסה בצורה אופקית על פניו של יצוק ג'ל ריק.
הכינו תמיסה של 1%AROS בתוך XTBE אחד וקררו ל-55 degrees Celsius. לאחר הקירור, שפכו את תמיסת הג'ל כדי ליצוק את הממד השני, תוך וידוא כי פרוסות הג'ל מכוסות לחלוטין. חשוב לוודא כי הפרוסות מכוונות באופן אחיד וכי התבנית מפולסת לפני יציקת הג'ל.
לאחר שהג'ל הת굳ב, הרץ את הממד השני במשך חמיש וחצי עד שבע שעות ב-6.5 vols לסנטימטר ביחידת אלקטרופורזה המאפשרת סירקולציה של הבאפר; המתח הגבוה ואחוז ה-Agros הגבוה בג'ל מפרידים ביעילות את מקטעי ה-DNA על בסיס הצורה שלהם וכן על בסיס גודלם. צורות לא לינאריות נעות לאט יותר בממד השני לאחר האלקטרופורזה. שטוף את הג'ל במים פעם אחת ולאחר מכן שטוף אותו פעמיים ב-400 milliliters של 0.25 molar hydrochloric acid למשך 15 דקות תוך כדי ערבוב עדין.
שטיפות החומצה נועדו ליצור חתכים חלקיים במולקולות ה-DNA למקטעים קטנים יותר, המועברים ביעילות רבה יותר במהלך ניתוח הסאד'רן (southern analysis), והן נחוצות בשל הגודל הרב והצורה הבלתי שגרתית של תוצרי הביניים של שכפול ה-DNA. כדי להכין את הג'ל להעברה בבסיס (alkali transfer), שטפו את הג'ל שוב במים, ולאחר מכן שטפו אותו פעמיים ב-400 milliliters של 0.4 molar sodium hydroxide למשך 30 דקות. לאחר מכן, ה-DNA בג'לים מועבר לממברנת nylon מסוג high bond n plus באמצעות מערכת העברה בסיסית כלפי מטה עם 0.4 molar sodium hydroxide, כפי שמתואר בחלק הכתוב של פרוטוקול זה; המתינו להעברת ה-DNA במשך שש עד 12 שעות. לאחר העברת ה-DNA, המשיכו בהיברידיזציה של הגשוש (probe hybridization) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.
לאחר בדיקת הממברנה ושטיפתה, הניחו אותה על נייר סופג עד שהנוזל ייעלם מהעין. לאחר מכן, עטפו את הממברנה בניילון נצמד (polyvinyl chloride) וחשפו אותה למסך phospho imager. לבסוף, ניתן להדגים ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות storm eight 40 ותוכנת ה-image quant הנלווית לו.
מוצגת תרשים של דפוס הנדידה של פלסמיד PBR 3 22 שעבר עיכול על ידי PV two, כפי שנצפה בניתוח ג'ל 2D agarose. פלסמידים ליניאריים שאינם משכפלים נעים כפרגמנט ליניארי בגודל 4.4 KB; פלסמידים משכפלים יוצרים מבנים דמויי Y שנדידתם איטית יותר מהפרגמנטים שאינם משכפלים, בשל גודלם הגדול יותר וצורתם הלא-ליניארית. דפוס נדידה זה יוצר קשת הנמתחת מהאזור הליניארי לכיוון הבאר לאחר הקרנה ב-UV.
מולקולות בצורת Y כפול או בצורת X נצפות באזור הקונוס ונדדות לאט יותר מקשת המולקולות בצורת Y. דוגמה לניתוח הדרומי של ג'ל דו-ממדי שנחשף ל-PBR 3 22 המסומן ב-P 32 מוצגת עבור תאים מיד לאחר הקרנת UV ו-15 דקות לאחר הקרנת UV מיד לאחר הקרנת UV. כ-1% מסך ה-DNA של הפלסמיד ניתן למצוא בקשת ה-Y כאשר תאים גדלים במהירות בשלב אקספוננציאלי לאחר הקרנה.
עלייה זמנית במולקולות בצורת Yה נצפית כאשר מזלגות שכפול חסומים מצטברים באתרים פגומים. גם תוצרי ביניים של שכפול בצורת L מצטברים באופן זמני ונשארים עד לזמן המתאם לתיקון הפגומים. הרגשנו להראות לכם כיצד ניתן להדמיות תוצרי ביניים של תיקון DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיות מודעים לכוחות גזירה שעלולים להפחית את התפוקה, ולהיזהר בטיפול בכל הדגימות והג'לים. זהו כל השלב. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג הליך לוויזואליזציה של תוצרי ביניים מבניים של DNA המתרחשים במהלך השכפול בעת מפגש עם נזקי DNA, ובייחוד לאחר הקרנה ב-UV. השיטה עושה שימוש בניתוח ג'ל אגרוז דו-ממדי כדי לזהות תוצרי ביניים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- שכפול DNA
- תגובה לנזקי DNA
- אלקטרופורזה של ג'ל
רקע
- שכפול עשוי להיעצר עקב נגעים ב-DNA.
- הבנת המבנה של תוצרי ביניים של השכפול חיונית למחקר של מנגנוני תיקון DNA.
- ניתוח ג'ל דו-ממדי מאפשר הפרדה מפורטת של מקטעי DNA.
- הקרנה בעזרת UV היא שיטה נפוצה להשראת נזק ל-DNA במסגרות ניסיוניות.
מטרת המחקר
- להדמיה של תוצרי ביניים מבניים של DNA במהלך השכפול.
- להערכת ההשפעה של נזקי DNA על תהליכי השכפול.
- להדגמת הצטברות של תוצרי ביניים של תיקון DNA במוטנטים ספציפיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד DNA מתאים שמתחלקים באופן פעיל עם נגקעים מושריים.
- הפרדת DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל על בסיס הגודל.
- יציקה מחדש של נתיבים לג'ל שני להפרדה נוספת לפי גודל וצורה.
- ניתוח סאות'רן (Southern analysis) להדמיה של מבני DNA הקשורים לשכפול.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של תוצרי ביניים של DNA לאחר נזק מקרינה UV.
- זיהוי שינויים מבניים ב-DNA כתוצאה מנגעים.
- ראיות להצטברות של תוצרי ביניים של תיקון במוטנטים מסוימים.
- הדגמת היעילות של אנליזת ג'ל דו-ממדי בחקר שחלוף ה-DNA.
מסקנות
- הפרוצדורה חושפת ביעילות את הדינמיקה של שכפול ה-DNA בנוכחות נזק.
- התובנות שנרכשו עשויות לסייע למחקרים עתידיים על מנגנוני תיקון DNA.
- ניתן להחיל שיטה זו על מודלים שונים של נזקי DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של תוצרי ביניים של השכפול של ה-DNA מספקת תובנה מכניסטית לגבי האופן שבו תאים מגיבים למעקה גנוטוקסי, ובכך מסייעת בתיקוף מטרות במסלולי התגובה לנזקי DNA. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים בשלב הפרה-קליני על ידי קישור פנוטיפים מולקולריים לקינטיקה של התיקון, מה שמאפשר ביטחון חיזוי באסטרטגיות טיפוליות המכוונות למעקה בשכפול. התשמישות של השיטה במודלים בקטריאליים מאפשרת בחינה בשלב מוקדם של מנגנונים שמורים הרלוונטיים למערכות של יונקים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת מזלג השכפול בעקבות נזק ל-DNA המושרה על ידי UV.
- ערך תפעולי: מבהיר תפקידים פונקציונליים של תוצרי גנים כגון RecA ומרכיבי מסלול RecF בעיבוד נגעים.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון במטרה על ידי קישור בין התמדת תוצרים ביניים לבין פעילות תיקון חיתוך נוקלאוטידים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטי DNA כמותיים, המופרדים לפי צורה וגודל, המתאימים לסטנדרטיזציה בין תנאים ניסיוניים שונים.
- שחזוריות: הפרדה דו-ממדית בג'ל מפחיתה את השונות על ידי הפרדת תוצרי ביניים על בסיס הגודל והקונופורמציה כאחד.
- תועלת לסריקה: מאפשר השוואה של פרופילי תוצרי ביניים של השכפול בין זני פרא (wild-type) לבין זנים עם פגם במנגנוני תיקון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מערכת הרלוונטית למחלה לצורך חקר מנגנוני עקה של שכפול השמורים מבקטריות ובני אדם.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין קינטיקת הסרת נגעים המושרים על ידי UV לבין פתרון תוצרי ביניים של השכפול, באופן המשקף את לוחות הזמנים של תיקון חלקיקי נוקלאוטידים (nucleotide excision repair).
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבחין בין היפוך זמני של מזלג השכפול לבין הצטברות פתולוגית של תוצרי ביניים, ובכך מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקה של התערבות במסלול.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ותומכת בבדיקת השערות בביולוגיה של תיקון DNA לפני שלבי זיהוי המולקולות המובילות (lead identification).
- ביולוגיה של הגילוי: בחינה של מודלים מכניסטיים של התנהגות מזלג השכפול תחת סטרס גנו-טוקסי באמצעות קריאות מבניות.
- סריקה: אספקת מבני DNA כמותיים ומוכנים לבדיקה, המאפשרים השוואה מקבילה של רקעים גנטיים.
- אנליטיקה: הפקת נתוני דפוסי נדידה המשקפים שינויים בצורתו ובגודלו של ה-DNA, התומכים בניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: קישור הדינמיקה של תוצרי ביניים בשכפול חיידקי למסלולי תיקון שמרניים באוקריוטים, כאשר הסרת נגעים נמצאת במתאם עם רזולוציית תוצרי הביניים.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מודולטורים גנטיים או כימיים של דיוק השכפול במגוון מודלים של נזק.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקון שחזור על ידי ויזואליזציה ישירה של תוצרי ביניים המושרים על ידי נגעים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זיהוי מבני DNA הקשורים לשחזור באמצעות הפרדה של גודל וצורה מבוססת ג'ל.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go ברמת המסלול על ידי קישור הצטברות תוצרי ביניים ליעילות התיקון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תיקוף פונקציונלי במטריקות של עיבוד נגעים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד DNA, אלקטרופורזה של ג'ל וטכניקות של Southern blotting.
- תלוי בגישה לציוד להקרנה ב-UV ומערכות סימון רדיואקטיבי או מערכות זיהוי של חומצות גרעיניות.
- מחייב טיפול סטנדרטי בדגימות כדי לצמצם שבירה של תוצרי ביניים שבירים של השכפול.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הפרוטוקול ממודלים בקטריאליים המבוססים על פלסמיד למערכות אחרות.
- מגבלות מעשיות כוללות שכיחות נמוכה של תוצרי ביניים וצורך באוכלוסיות תאים מסונכרנות כדי לזהות מינים חולפים.
