שמירה ב Wolbachia בינוני סלולרי חינם
4 ביולי 2007
וידאו זה מתאר שיטה לטיהור Wolbachia pipientis מקו תא אנופלס gambiae ואז culturing endosymbiont במדיום הסלולרי חינם. Assay עבור הכדאיות של החיידק הוא הוכיח.
שמי קורטני סטון. אני עובדת בבית הספר לבריאות הציבור בלומברג של ג'ונס הופקינס במעבדתו של ד"ר ג'ייסון רסקון. היום נבצע טיהור חיידקים מתאי חרקים מתורבתים.
זהו למעשה הליך פשוט מאוד. אנו מתחילים באיסוף התאים ולאחר מכן מבצעים פירוק פיזי של ממברנות התאי המארח האיקריוטי באמצעות ליזיס של חרוזי זכוכית. לאחר מכן, אנו משתמשים בצנטריפוגציה דיפרנציאלית כדי להפריד את החיידקים משאריות התאי המארח.
לאחר מכן אנו משתמשים בסדרה של שלבי סינון כדי להסיר עוד יותר חלקיקי תאי מאכסן, כך שבסוף נותרים רק עם המשקע הבקטריאלי המטוהיר. זהו למעשה אחד הדרישות המרכזיות. זוהי תא מטורית לתרביות תאים, והיא משמשת לשמירה על סטריליות של כל התהליך, כיוון שתרביות תאים נדבקות לזיהומים בקלות רבה.
אנחנו זקוקים גם למצע גידול תאים, לתאים עצמם, ואנו מגדלים אותם בבקבוקי פלסטיק. נזדקק גם לחרוזי טחינה של 3 mm, למבחנות קוניות של 50 ml, ולצנטריפוגה המסוגלת לבצע סבוב במהירות גבוהה, כ-18,000 G כדי לשקע את החיידקים שלנו, אך מסוגלת גם לבצע סבוב של כ-3,000 G או 2,500 G כדי לשקע את תאי המאכסן שלנו. לכן, הדבר הראשון שנעשה הוא להתחיל עם התאים שגידלנו.
הם גדלו, נכון? אלו בקבוקי T 75. יש בהם 15 mls של מצע תרבית וגם אותנו.
הדבר הראשון שנעשה הוא להתחיל בפירוק שכבת התאים ואיסופם לשפופרת צנטריפוגה של 50 ml. יש פשוט להניע את השפוד למעלה ולמטה על שכבת התאים, מה שיגרום להעתקתם של כל התאים אל המצע. לאחר שהתאים נמצאים במצע, נעביר אותם באמצעות פיפט לשפופרת קונית של 50 ml.
כעת, לשתי תרחיפי התאים, נוסיף חרוזי זכוכית של 3 mm. חרוזים אלו עברו עיקור באוטוקלאב וניתן למעשה להשתמש בהם שוב. ניתן לשטוף ולהשרות אותם בתמיסת אקונומיקה ולאחר מכן לעקר אותם באוטוקלאב לפני השימוש החוזר.
שפכו את התוכן תוך כדי וידוא שפיית צנצנת הזכוכית B אינה נוגעת בפתח מבחנת הצנטריפוגה. אנו שמים כמות של חרוזי זכוכית השווה לנפח של כ-5 ml לתוך כל מבחנת צנטריפוגה, עד לסימון של 5 מיליליטר. השלב הבא הוא ביצוע פירוק פיזי של תאי ה-eary כדי לשחרר את החיידקים שלנו לתוך התמיסה.
אנו משתמשים בורטקס (vortex), מכוונים אותו להגדרת הרעידה הגבוהה ביותר, ומרעידים למשך חמש דקות. כעת נרעיד את התאים עם חרוזי זכוכית של 3 mm למשך חמש דקות, ולאחר מכן נשאיב את supernatant באמצעות פיפטה נקייה לתוך מבחנה צנטריפוגית סטרילית ונקייה של 50 mL. אנו מקבלים את התרחוף שיצרנו, שכולל את החיידקים ששוחררו ואת התמיסה, וכן את שיירי התאים.
השלב הבא שנבצע הוא סבב צנטריפוגציה במהירות נמוכה, כדי שנוכל לשקיע את החומר הגולמי ולהשאיר את החיידקים בתמיסה. נשתמש בצנטריפוגה ב-2,500 ×g למשך 10 דקות. כמו כן, נבצע את הצנטריפוגציה בטמפרטורה של 4 °C כדי לסייע באיסוף המשקע בתחתית.
כעת נמקם זאת כאן, נוודא שהמשקל מאוזן, נסגור את המכשיר ונסחרב למשך 10 דקות. כעת סחרבתי את הנוזל העליון המכיל שאריות תאי מאכסן וכן את החיידקים המטוהרים. ביצעתי זאת ב-2,500 G למשך 10 דקות.
וכפי שניתן לראות, יש לי משקע בתחתית המבחנה המורכב משאריות תאיים. החיידקים ששוחררו לאחרונה עדיין נמצאים בנוזל העל (supernatant) מכיוון שהסבוב בצנטריפוגה לא היה חזק מספיק כדי להשקיע גם אותם. לכן, הפעולה הבאה שאבצע היא הסרת הנוזל העל וסינונו דרך מסנן של 5 מיקרון.
זהו מסנן של 5 µm והוא מתאים לכל סוג של מזרק. אני עומדת להשתמש במזרק של 30 ml, אך פשוט מושכים את הבוכנה כלפי מעלה, ואז מבלי לגעת במסנן עצמו, ובמיוחד בחלק התחתון, שכן הוא חייב להישאר סטרילי. אנחנו מחברים את המזרק למסנן פשוט על ידי הברגה, ואז לוחצים בעדינות על הבוכנה כדי להעביר את ה-supnatant דרך המסנן ואל תוך המבחנה שלנו.
אין ללחוץ חזק מדי, שכן הדבר עלול לשבור את המסנן ולהוביל להפסקת תפקודו. אם הגעתם למצב שבו עליכם להפעיל לחץ רב, יש להסיר את המסנן ולהחליפו, כיוון שפירוש הדבר הוא שהוא סתום משאריות תאים רבות. בנקודה זו, בהתאם לנפח שלנו וכשיטה נוספת להשגת תרבית חיידקים טהורה מאוד, אנו מוסיפים לשפופרת הצנטריפוגה המהירה תמיסת sucrose בריכוז 250 millimolar שעברה סטריליזציה באמצעות סינון.
יש למלא את הבקבוק עד לנפח של לפחות 80%. בדרך כלל אנו ממלאים אותו עד לצוואר. יש למלא את המבחנות הללו בנפח זה כדי למנוע מהן לקרוס פנימה בתוך הצנטריפוגה המהירה שלנו.
כעת נסובב את התסנן שלנו כדי להשיג את החיידקים המזוהים ב-18,000 ×g בצנטריפוגה מהירה זו. עלינו לוודא שהמבחנות ממוקמות בצורה מאוזנת, כמובן, ולאחר מכן נסגור את המכשיר. נקבע את זמן הסבב ל-10 דקות.
אנו מעדיפים לבצע זאת בטמפרטורה של 10 °C או פחות, כפי שהטמפרטורה שלנו מוגדרת כאן. המהירות הזוויתית עבור הרוטור הספציפי הזה בצנטריפוגה היא 12.5 revolutions per minute. יש לנו טבלת המרה, כך שהסבב יהיה בערך 18,670 ×g. כעת ביצענו את הסבב בצנטריפוגה במהירות גבוהה כדי לשקיע את הבקטריות המזוקקות שלנו למשקע.
כפי שניתן לראות, יש לנו כעת משקע חיידקי יפה בתחתית המבחנה המהירה. לכן, מה שנעשה כעת הוא להסיר את כל הנוזל העליון (supernatant) למכל פסולת נוזלית. השלב הבא הוא לבצע ריסוספנזיה (resuspend) של החיידקים שלנו.
אני עומד להמיס אותו שוב בשני מיליליטר של תוצר התרבית שלנו, שהוא Schneider's insect medium, מועשר ב-10% fetal bovine serum שעבר אינאקטיבציה תרמית. אני פשוט אמיס את המשקע על ידי פיפוט מעלה ומטה עד שכל הבקטריות יחזרו לתמיסה. כעת, כשהבקטריות נמצאות שוב בסספנסיה, נבצע שלב טיהור נוסף רק כדי להיפטר מכל שארית אפשרית של תאי מאכסן.
עבור שלב זה, נשתמש במסנן של 2.7 מיקרון. אני מעדיפה להשתמש במעטפת הפלסטיק של מסנן ה-5 מיקרון שלנו כתושבת. ניתן לשאוב את התמיסות, להבריג את המזרק אל מסנן ה-2.7 מיקרון, וכעת נסנן את התמיסה אל תוך מבחנה לאחסון לטווח ארוך.
בדומה למסנן האחר, פשוט לוחצים בעדינות על הבוכנה. וכעת יש לנו את התמיסה של החיידקים המזוקקים. הדבר הבא שאראה לכם הוא כיצד אנו בודקים את החיוניות.
אנו משתמשים בערכה לבדיקת חיוניות חיידקים (live dead bacterial viability kit) של חברת molecular probes. ערכה זו כוללת שני צבעים: propidium iodide ו-cyto nine. ה-propidium iodide פולט פלואורסצנציה אדומה, והוא צובע רק חיידקים שהמעטפת הבקטריאלית שלהם אינה שלמה לחלוטין, בעוד ש-cyto nine צובע את כל החיידקים.
לכן, כאשר בוחנים את החיידקים הללו תחת מיקרוסקופ המצויד באופטיקה פלואורסצנטית, כל החיידקים יפגינו פלואורסצנציה בירוק, ותת-קבוצה מהם, אלו המתים, יפגינו פלואורסצנציה באדום. אנו לוקחים אליקוט קטן מהדגימה המטוהרת שלנו, ובמקרה זה אקח 10 µL בלבד, כמות המספיקה להכנת סלייד אחד. ואני אחלק זאת לשני סליידים נוספים.
כעת אוסיף את שני הצבעים הנוספים שלנו, מיקרוליטר אחד של תערובת ה-propidium iodide וה-cyto nine לתליה הבקטריאלית. לאחר מכן ניתן להדגיר את הדגימה בחושך למשך 15 דקות. עם זאת, מצאנו שניתן להמשיך למריחה על זכוכית ולהבחין בתוצאות כמעט באופן מיידי.
בסדר, כעת אני עומד לבחון במיקרוסקופ את הפיתח שלי המכיל את החיידקים שנצבעו בצבע חי/מת עם תאורה אחורית. נטפטף את הצבע על הפיתח, נניח זכוכית כיסוי ואז נבחן. אשתמש במסנן המשולב אדום-ירוק כדי שאוכל להעריך את החיוניות של החיידקים שלי.
כאשר אני פותח את התריס, אני רואה את החיידקים שלי, הם נראים פחות או יותר כנקודות זעירות. אך אני רואה כאן שבערך 90% עד 95% מהחיידקים הם ירוקים, בעוד שרק בערך, הייתי אומר, 5% הם אדומים. אם כך, יש לנו שיעור חיוניות גבוה מאוד, נכון?
כעת סיימנו לעבור על תהליך הטיהור של Akia חיונית מתאי חרקים בתרבית. פרוטוקול זה כלל פירוק פיזי של תאי המארח האיקריוטיים ולאחר מכן סרכזגציה דיפרנציאלית כדי לבודד את החיידקים המטוהרים, וכן סדרה של שלבי סינון כדי להבטיח את איכות החיידקים המטוהרים ולטהר אותם לחלוטין מכל רכיבי תאי המארח. לאחר מכן, עברנו על בדיקת live/dead עם תאורה אחורית, המשתמשת בשני צבעים כדי להעריך את חיוניות החיידקים שלכם.
כעת ניתן להשתמש בחיידקים המ purified שלכם במגוון יישומים, כולל הדבקה של מערכות תאי תרבית אחרות כדי להגביר את ההדבקה של מערכת ספציפית. ניתן גם לבצע מחקרי מטבוליזם או מחקרים רבים אחרים באמצעות החיידקים המ purified החיים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מתאר שיטה לטיהור של Wolbachia pipientis משורת תאים של Anopheles gambiae וגידול של האנדוסימביונט במצע ללא תאים. כמו כן, מוצג בדיקה לבדיקת חיוניות החיידק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- פיזיולוגיה של חרקים
רקע
- Wolbachia pipientis היא חיידק אנדו-סימביוטי המצוי במיני חרקים רבים.
- הבנת תהליכי הטיהור והגידול שלו חשובה למחקר בביולוגיה של וקטורים.
- קווי תאי חרקים מהווים מודל לחקר אנדו-סימביונטים.
- בדיקות חיוניות הן קריטיות לאישור גידול מוצלח של חיידקים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה לניקוי Wolbachia מתאי חרקים.
- לבסס פרוטוקול לגידול החיידק במצע ללא תאים.
- לספק בדיקת חיוניות עבור החיידקים שגודלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר של שורת תאי Anopheles gambiae.
- פירוק פיזי של ממברנות תאי המאחס באמצעות ליזיס עם גלובולי זכוכית.
- צנטריפוגציה דיפרנציאלית להפרדת החיידקים מהפסולת התאית.
- בדיקת חיוניות חיידקים לאחר הטיהור.
תוצאות עיקריות
- טיהור מוצלח של Wolbachia pipientis מתאי חרקים.
- ביסוס של שיטת תרבית נטולת תאים עבור החיידק.
- הדגמה של בדיקת חיות יעילה עבור החיידקים שגודלו בתרבית.
- תובנות לגבי המתודולוגיה הישומה למחקרים דומים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לניקוי וגידול של Wolbachia.
- בדיקות חיוניות הן חיוניות לאישור גידול מוצלח.
- מחקר זה תורם להבנתם של חיידקים אנדו-סימביוטיים בחרקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טיהור והערכת חיוניות של Wolbachia במצע נטול תאים מאפשרים מחקרים מבוקרים של ביולוגיה של אנדוסימביונטים, ובכך תומכים בגילוי מוקדם ובתיקוף יעדים במחקר של מחלות המועברות על ידי וקטורים. זרימה זו מספקת גישה סטנדרטית להפקת Wolbachia חיונית חוץ-תאית המתאימה ליישומים המשכיים, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במחקרי אינטראקציה בין מאח ומיקרוב. השיטה תומכת בהחלטות תיק מסחרי על ידי מתן אפשרות להכנה הדירה של חומר ביולוגי למחקרים של זיהום, מטבוליזם וגנטיקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בידוד של Wolbachia לצורך מחקרים מכניסטיים של אינטראקציות בין מאח ומיקרואורגניזם.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של תפקידי הסימביונט בביולוגיה של וקטורים.
- מקל על בחינה מונחית-היפותזה של השפעת האנדוסימביונט על מערכות המאח.
- מספק פלטפורמה להפחתת סיכונים ביולוגיים במחקר על בקרת וקטורים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק Wolbachia מטוהר וחי עבור בדיקות הדבקה סטנדרטיות.
- מאפשר הערכה כמותית של חיוניות באמצעות בדיקות חי/מת המבוססות על פלואורסצנציה.
- תומך בהכנה ניתנת לשחזור של ריאגנטים ביולוגיים עבור פיתוח בדיקות.
- משפר את מוכנות הבדיקה להערכת השפעות של תרכובות על חיוניות הסימביונט.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק רציפות למחקרים הקושרים ממצאים in vitro לאסטרטגיות של בקרה על וקטורים.
- מאפשר הכנה של חומר למיקרו-הזרקה ומיצוי DNA בתהליכי עבודה תרגומיים (translational workflows).
- תומך בהקדמה מותאמת-סיכונים של התערבויות מבוססות סימביונטים.
- מקל על ההלימה למודלים של וקטורים הרלוונטיים למחלה כאשר הדבר נתמך על ידי יישומים המשכיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת את ההכנה והערכת החיות של Wolbachia עבור מחקרי הדבקה, מטבוליזם וגנטיקה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים של תפקודי סימביונטים במערכות מאכסן.
- סריקה: מספק חיידקים חיים ומאומתים עבור בדיקות הדבקה ובדיקות חיוניות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של חיוניות חיידקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחקר תרגומי: מספק חומר להזרקה מיקרוסקופית ומיצוי DNA במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול סטנדרטי להפקת Wolbachia חוץ-תאי עבור יישומי מו"פ מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי מאח-מיקרובה ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק הכנה סטנדרטית, הניתנת לשחזור ובעלת יכולת הרחבה של סימביונטים חיוניים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקת (go/no-go) תוכניות מחקר מבוססות סימביונטים.
- השפעה על הפורט폴יו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של פרויקטים לבקרת וקטורים ופרויקטים המכוונים לסימביונטים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות סטריליות ובמערכי עבודה של תרביות תאים.
- נדרשת גישה לתשתיות של סרטוריגציה במהירות גבוהה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים לצורך הדירות (reproducibility).
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור תאי מאכסן או מערכות סימביונטים שונות.
- הערכת החיוניות מוגבלת לתחזוקה חוץ-תאית לטווח קצר; שחזור מחייב הזרקה מחודשת לתאי מאכסן.
