ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית
19 בינואר 2011
על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע מידע סטוכיומטרי ומבני על חלבון. בכל קומפלקסי הליגנד המבטאים תאים ביולוגיים חיים, תאי שמרים הונדסו גנטית כדי לבטא את החלבונים הרלוונטיים המחוברים או לגשושית פלואורסצנטית תורמת או לגשושית מקבלת. ניתן לעורר גשושיות תורמות באופן ישיר באמצעות לייזר.
בעוד שמקבלים יכולים להיות מעוררים רק באמצעות העברה של אנרגיה מתורם מעורר סמוך, התאים נחשפים לאור מלייזר אינפרא-אדום קרוב בפולסים. הפלואורסצנציה הנפלטת מהגששים מופרדת לרכיביה הספקטרליים באמצעות סריג תמסירה ומוקרנת על פני מערך CCD מכפל אלקטרונים. לפיכך, מתקבלים ספקטרום פלואורסצנציה מלא מכל רכיב בודד עבור כל מיקום בדגימה.
הפרופיל הספקטרלי של הפלואורסצנציה שהזוהתה תלוי באינטראקציה הספציפית של החלבונים הנבדקים. הנתונים מנותחים כדי לקבוע, עבור כל פיקסל בתמונה של תא סריקה, את הפליטות הנפרדות מהגששים התורמים והמקבלים. יעילות העברת האנרגיה נקבעת בכל פיקסל בתמונה, ולאחר מכן הפיקסלים ממוינים לפי יעילות ה-fret שלהם והיסטוגרמה.
ניתוח ההיסטוגרמה מאפשר קביעה in vivo של גודל החלבון, הקומפלקס והקונפיגורציה שלהם. שלום, שמי מייקל סטונמן מקבוצת המחקר Riku באוניברסיטת ויסקונסין מילוואוקי. שמי סינג.
אני ממעבדת Rikus ב-Milwaukee, Wisconsin. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שפרופילי הפליטה המלאים של מאות קומפלקסים של ליגנדים בתוך תא מתקבלים באמצעות סריקה אחת מלאה של התא. בדרך כלל, רוב שיטות מיקרוסקופיית הפלואורסצנציה דורשות סריקה חוזרת של התא הנבדק מספר פעמים כדי לצבור מספיק מידע ספקטרלי המאפשר לקבוע את יעילות ה-fret באזורי עניין שונים בתוך התא.
עם זאת, תגובות ביוכימיות של דיפוזיה עשויות לשנות את ההרכב המולקולרי של אזורי העניין הללו ובכך להגביל את המידע המתקבל בסריקה של התמונה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בחקר חלבונים ואינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים, כגון מהו הגודל של האוליגומרים המזיקים? באיזה שלב במחזור החיים של החלבון נוצרים האוליגומרים, ומהו תפקידם של אוליגומרים של חלבון זה בתפקוד התאי?
המיקרוסקופ הפוטוני בעל רזולוציה ספקטרלית צובר מידע ספקטרלי על קומפלקסים של olima בתא הדמיה, על ידי סריקה של מיקוד קרן העירור על פני הדגימה המבוקשת במספר מיקומים. זוג מראות סריקה אורטוגונליות משמש להזזת מיקוד קרן הלייזר על פני הדגימה בשני כיוונים שונים. תנועת מראות הסריקה נשלטת במחשב ומסונכרנת עם חילוץ נתוני עוצמת הפלורסצנציה ממצלמת ה-CCD; מתוך סריקות השורות ניתן לשחזר מפות מרחביות של עוצמת הפלורסצנציה המתאימות לאורך גל מסוים של אור.
על מנת לשחזר במדויק מפות מרחביות של עוצמת פלואורסצנציית קרני X ולחשב את אורך הגל הממשי המתאים לכל אחת ממפות אלו, יש לכלול כיול של פרוטוקול סריקת הקווים באמצעות תמיסת פלואורסצאין. כדי להתחיל בהליך הכיול, שלחו את ספקטרום העירור באורך גל של 800 nanometers, שהוא פי שניים מאורך גל העירור המקסימלי של תג התורם GFP two two. כדי לשלוח את ספקטרום העירור, העבירו את הפריזמה הממוקמת בתוך חלל הלייזר כדי לשנות את פיזור מהירות הקבוצה באמצעות תוכנת המחשב המקושרת למצלמה. שלחו פקודה לשבב ה-CCD כדי להוריד את טמפרטורת שבב ה-CCD לטמפרטורה הנמוכה ביותר שניתן להשיג.
במטרה להפחית רעש רקע, טפטף בעזרת פיפטה 10 µL של תמיסת פלואורסצאין על זכוכית כיסוי של סרטית מיקרוסקופ, כך ששכבה דקה של הדגימה תתפזר באופן אחיד באזור שבין זכוכית הכיסוי לסרטית. הנח טיפה קטנה של שמן טבילה על פני זכוכית הכיסוי. כעת, קבע את סרטית המיקרוסקופ לבמה עם התרגום XY, Z, והזז את הסרטית ואת הבמה בכיוון הציר האופטי. על ידי כיוון ידני של המפעיל הליניארי, הזז את הסרטית עד שהעדשה של המיקרוסקופ תיכנס במגע עם טיפת שמן הטבילה. העבר את המצלמה למצב וידאו של רכישת נתונים, כך שהאור הפוגע במערך ה-CCD יוצג על מסך המחשב בזמן אמת.
כבה את כל תאורת החדר כדי להפחית את רעש הרקע המזוהה במערך ה-CCD. כוונן באיטיות את המיקרומטר השולט בבמה המניעה בכיוון הציר האופטי כדי להביא את הדגימה לנקודת המיקוד של קרן הלייזר. כאשר דגימת הפלואורסצאין תהיה במיקוד, הפליטה תופיע כקו חד במערך ה-CCD.
הורד את קריאת עוצמות הפיקסלים ממערך ה-CCD למחשב. מדוד את עוצמת הפיקסל כפונקציה של המיקום במערך ה-CCD על ידי פתיחת המטריצה שהורדה של ערכי העוצמה ב-ImageJ ושרטוט קו העובר דרך האזור הפלואורסצנטי. השתמש בפקודת image day.
נתחו את פרופיל העלילה כדי ליצור גרף הממחיש את ספקטרום הפליטה של דגימת הפלואורסצאין. כווןנו את פרמטר המדרגה של המראה, השולט בתנועת הלייזר. התמקדו בכיוון ציר Y, כך שמיקומים סמוכים בציר ה-y בתוך הדגימה יביאו לתזוזה של שיא ספקטרומי הפלואורסצנציה בדיוק בפיקסל אחד לאורך הממד הספקטרלי במערך ה-CCD.
כדי לנטר זאת, הורד את עוצמת ספקטרום הפלואורסצאין עבור שני מיקומי Y שונים בדגימה. לאחר מכן, פתח את תמונות העוצמה באמצעות Image J ומצא את מיקום פיקסל השיא עבור כל אחד מספקטרומי הפלואורסצנציה. באמצעות הסמן של Image J, כאשר תריס ה-CCD נשאר פתוח, סרוק את פוקוס הלייזר לאורך הדגימה בכיוון X.
האור הנפלט מכל ווקסל לאורך קו הסריקה צריך להגיע אל מערך ה-CCD שבסוף כל סריקת שורה; יש לאחסן את הנתונים ממערך ה-CCD שהתקבלו עבור סריקת שורה זו, ולאחר מכן לנקות את הפיקסלים של מערך ה-CCD. העבירו את מיקום הלייזר. בצעו מיקוד בכיוון Y לפי הכמות שנקבעה קודם לכן.
לאחר מכן, סרוקו את קרן הלייזר בכיוון ציר X לרוחב הדגימה. שוב, השאירו את התריס של ה-CCD פתוח ושמרו את הנתונים. חזרו על הליך סריקת השורות עד ששטח פיזי הגדול בכ-50% מממדיה של תא ביולוגי בודד הופעל על ידי אור הלייזר.
יש להשתמש בקשר שבין מספר השורה של תמונת סריקה קוית מסוימת לבין אורך הגל כדי לשחזר את התמונות ולהשיג מפות פנים של עצימויות פלואורסצנציה רבות באורכי גל שונים. כדי להשיג את תמונת הפליטה הפלואורסצנטית עבור אורך גל מסוים, יש למצוא בתמונה שהתקבלה מהסריקה הקוית הראשונה את מספר השורה המתאימה לאורך גל זה. לאחר מכן, השורה הסמוכה בתמונת הסריקה הקוית הבאה תתאים לשורה הבאה בתמונת הפליטה הפלואורסצנטית.
עבור מחסנית אורך הגל הספציפית הזו, ערמו את כל שורות התמונות המתאימות לאורך גל זה כדי לקבל את מפות העוצמה הפלורסצנטית המרחביות של הדגימה במישור XY באותו אורך גל. חזרו על הליך זה עבור כל שאר אורכי הגל הניתנים להשגה כדי לאסוף נתונים על הדגימות שלכם. ראשית, הוציאו מהאינקובטור את הצלחות עם מושבות השמרים שעברו טרנספורמציה.
צריכים להיות לפחות שלושה סוגים של תאים שעברו טרנספורמציה. תאים המבטאים את החלבונים הנחקרים המסומנים בשני סוגי הגששים הפלואורסצנטיים, תאים המבטאים רק חלבונים המסומנים בגששים הפלואורסצנטיים התורמים, ותאים המבטאים רק חלבונים המסומנים בגששים הפלואורסצנטיים המקבלים.
הוסיפו 100 µL של פוטסיום כלוריד בריכוז 100 mM למבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, באמצעות טיפ של מיקרו-פיפט, גרדו שלוש עד חמש מושבות שמרים מצע התאים המבטאים חלבונים המסומנים הן עם גשושית תורם והן עם גשושית מקבל פלואורסצנטית, והחדירו אותן לתוך ה-100 mM פוטסיום כלוריד. מתרחיף תאים זה, הוציאו 10 µL והניחו אותם על זכוכית מיקרוסקופ נקייה.
כסו את הטיפה עם זכוכית כיסוי והניחו טיפת שמן על פני זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, סגרו ידנית את התריס בנתיב קרן הלייזר כדי למנוע מאור הלייזר להגיע לעדשת המיקרוסקופ. הדקו את סרט המיקרוסקופ לשולחן ההזזה XY, Z והזיזו את שולחן הדגימה בכיוון הציר האופטי עד שעדשת המיקרוסקופ תיכנס במגע עם טיפת שמן הטבילה.
כעת הדליקו את תאורת השדה הרחב ועברו למצלמה. מצב וידאו של איסוף נתונים. תמונת השדה הרחב של הדגימה תהיה מטושטשת מאוד בשל נוכחות סריג התמסורת בנתיב הפליטה.
לפיכך, מקמו מסנן חסימת פס (band pass filter) בעל רוחב חצי מקסימום (full width half maximum) קטן במסלול האופטי לפני סריג התמסירה. הזיזו לאט את במת ההזזה בכיוון הציר האופטי תוך צפייה בדמות התאים על מסך המצלמה עד שהתאים יגיעו למיקוד. הזיזו את הבמה בכיוון X או Y כדי להביא תא בודד למיקום המוקד של קרן הלייזר.
כבה את מקור התאורה בשדה רחב (widefield) והסר את מסנן נתיב הפס (band path filter) מנתיב הפליטה. פתח את חסימת קרן הלייזר לזמן קצר תוך צפייה בו-זמנית באות המתקבל במערך ה-CCD. אם מזוהה אות פלואורסצנציה במערך ה-CCD בזמן שקרן הלייזר פוגעת בתא, בצע סריקה מלאה של רכישת נתוני פלואורסצנציה עבור תא זה.
חיוני להשתמש באותם פרמטרי סריקה, ובמיוחד במספר השורות ובמרווח ה-y כפי שנקבעו בהליך הכיול שהודגם קודם לכן. חזור על תהליך איתור התאים ואיסוף נתוני הפלואורסצנציה עבור מספר רב של תאים המבטאים חלבון המחובר הן לתגי תור (donor tags) והן לתגי מקבל (acceptor tags). לאחר צבירה של מספיק תמונות פלואורסצנציה של תאים המבטאים חלבונים המסומנים בשני הרצפטורים, חזור על התהליך כולו הן עבור תאים המבטאים רק חלבונים המסומנים ב probes פלואורסצנטיים של תור, והן עבור תאים המבטאים רק חלבונים המסומנים ב probes פלואורסצנטיים של מקבל.
לבסוף, שחזרו את כל הסריקות כדי להשיג מפות מרחביות של עוצמת פלואורסצנציה ב-XY בעלות רזולוציה ספקטרלית עבור כל סט נתונים, באמצעות הפרוצדורה שתוארה קודם לכן. שלוש דמויות אלו ממחישות את המפות המרחביות שהתקבלו מחישובים של מדידות מיקרוסקופיה של שני פוטונים ברזולוציה ספקטרלית, שבוצעו על תא שמר שמבטא את ה-sterile to alpha factor receptor. מפות דו-ממדיות של אותות תורם (donor) ומקבל (acceptor) התקבלו מניתוח פרופילי הפליטה הספקטרליים שנמדדו בכל מיקום בתא.
לעוצמות הפלואורסצנציה הוקצו צבעים מדומים על פי ערכיהן, והסולם מוצג כהסבר פנימי (inset). מפה דו-ממדית של יעילויות ה-fret הנראות חושבה לאחר מכן באמצעות תמונות ה-KDA וה-KAD, תוך שימוש בערכים שהופקו ממפת יעילויות ה-fret הנראות של התא שהוצג זה עתה, והוכנה תרשים היסטוגרמה. ערכי ה-EAPP שנמדדו עבור התא מיוצגים על ידי עיגולים.
הקו האדום הרציף מייצג את ההתאמה הטובה ביותר לנתונים הנמדדים באמצעות סכום פונקציות הסידן הבודדות המיוצגות על ידי קווים ירוקים רציפים. ניתוח ההיסטוגרמה, המתוארת בטקסט הפרוטוקול, מאשר כי קומפלקס הליגנד של קולטן גורם alpha 2 העקר מקבל את צורתו של טטראמר בצורת RBA באופן vivo. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 12 שעות, אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לשמור על עוצמה נמוכה של מקור העירור. חשוב להימנע מעירור מרובה של התורם על ידי פולס בודד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה יעשה שימוש במערכת דימוי של מיקרוסקופיה דו-פוטונית בעלת רזולוציה ספקטרלית כדי להשיג מפות ברמת הפיקסל של יעילויות העברה של אנרגיה בתהודה של פרסטר (FRET) בתאים המבטאים רצפטורים של ממбраנה. מפות יעילות ה-FRET מאפשרות להעריך מידע סטוכיומטרי לגבי קומפלקסים אוליגומריים הנבדקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- העברה של אנרגיית תהודה של פרסטר (FRET) היא טכניקה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
- הבנת הסטוכיומטריה של קומפלקסים של חלבונים היא חיונית להבהרת תפקודיהם.
- מיקרוסקופיה של שני פוטונים מאפשרת דימוי של רקמות עמוקות תוך גרימה לנזק פוטוכימי מינימלי.
- תאים מהונדסים גנטית יכולים לבטא חלבונים ספציפיים המסומנים בגששים פלואורסצנטיים לצורך אנליזת FRET.
מטרת המחקר
- לקביעת מידע סטוכיומטרי ומבני על קומפלקסים של חלבונים.
- לחקר התגשמותם של קומפלקסים הומו-אוליגומריים בתאים חיים.
- להעמקת ההבנה של אינטראקציות בין רצפטורים ברמה התאית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הנדסה גנטית של תאי שמרים להבעת חלבונים רצויים עם גששים פלואורסצנטיים.
- עירור של גששי תורם באמצעות לייזר פולסי בטווח האינפרא-אדום הקרוב.
- הפרדה של פליטות פלואורסצנטיות לרכיבים ספקטרליים באמצעות סריג תמסירה.
- הקרנה של נתונים ספקטרליים על מערך CCD מכפיל אלקטרונים לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- מפות יעילות FRET ברמת הפיקסל הופקו בהצלחה.
- מידע סטוכיומטרי על הקומפלקסים האוליגומריים נאמד מתוך מפות ה-FRET.
- המתודולוגיה הדגימה דימות יעיל של תאים ביולוגיים חיים.
- התקבלו תובנות לגבי האינטראקציות של רצפטורים ממברנליים.
מסקנות
- המחקר מספק גישה חדשנית לניתוח אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים.
- דימוי FRET יכול לחשוף פרטים חשובים על היווצרות של קומפלקס רספטורים.
- לטכניקה זו פוטנציאל ליישומים בהבנת תהליכים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת כימות ברמת הפיקסל של אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיית דו-פוטון עם רזולוציה ספקטרלית, ובכך מספקת תובנות סטוכיומטריות ומבניות לגבי קומפלקסים אוליגומריים. על ידי לכידה של נתונים ספקטרליים מלאים בסריקה אחת, היא מפחיתה ארטיפקטים זמניים הנובעים מדינמיקה מולקולרית במהלך הרכישה, ובכך משפרת את מהימנות הנתונים לצורך תיקוף מטרות. הגישה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת מצבי האוליגומריזציה של רצפטורים, דבר המגביר את הביטחון החזוי במאמצי סריקה וזיהוי מובילים (lead identification) בשלבים הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קביעת הגודל והקונפיגורציה של אוליגומרים של קולטני ממברנה כגון GPCRs in vivo.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של סטוכיומטריה מורכבת, ובכך מפחית עמימות בנוגע למנגנון המטרה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת מפות יעילות FRET כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית המתאימות למצבים פונקציונליים של הקולטן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות המבטאות רצפטורים מתויגים לסריקת תרכובות בהמשך, עם קווי בסיס מוגדרים לאינטראקציה.
- פלט כמותי: יצירת מדידות יעילות FRET ברמת הפיקסל המאפשרות קריאות הניתנות לשחזור ובעלות רזולוציה ספקטרלית לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מאפשר זרימות עבודה של דימיון הניתנות להרחבה (scalable) וניתנות להחלה על כל חלבון מתויג פלואורסצנטית, ובכך תומך בשימוש חוזר במיכשור בין פרויקטים שונים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בקולטנים סטריליים ל-2 α-factor המבטאים בשמרים כמודל לאוליגומריזציה של GPCR, בהלימה למחקרים תרגומיים של תפקוד קולטנים בהקשרים דמויי-טבעיים.
- המשכיות מכניסטית: מגשר בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי קישור מבנה האוליגומר לתפקוד תאי, ובכך תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי התקדמות מותאמת-סיכון.
- הלימה לסמנים ביולוגיים: מאפשר קורלציה בין מצבי אינטראקציה לבין סיגנלינג במורד המסלול, ובכך מספק מידע למודלים פרה-קליניים מרובדים לפי סמנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה דרך פיתוח בדיקה ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספקת נתוני אינטראקציה ברזולוציה מרחבית המנחים את זיהוי המולקולות המובילות (leads) ומעקב מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי פענוח מצבי אוליגומריזציה של GPCRs בתאים חיים, ובכך מפחיתה אי-ודאות מכניסטית.
- סריקה: מספקת מפות פלואורסצנציה שחזרות ומוכנות לבדיקה עם פלטי FRET כמותיים, המאפשרים סריקה מהימנה של תרכובות מול קווי בסיס מוגדרים של אינטראקציה.
- אנליטיקה: מספקת הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) וניתוח מבוסס היסטוגרמה של יעילויות FRET, המניבים השוואות כמותיות בין תנאים שונים לצורך אופטימיזציה של מובילים (leads).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מבנה האוליגומר לתפקוד במערכת הרלוונטית למחלה, ובכך תומכת בהתאמה של סמני ביולוגים (biomarkers) ובהמשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת דימוי הניתנת לשימוש חוזר לחקר של כל חלבון המסומן פלואורסצנטית בתאים חיים, ובכך ממקסמת את תועלת הפלטפורמה לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באוליגומריזציה של רצפטורים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות רכישת ספקטרום בסריקה אחת, ובכך ממזער שונות זמנית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת תובנות מבניות המפחיתות סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של פיתוח תרופות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על סטוכיומטריה מאומתת של אינטראקציות וקונפיגורציה של קומפלקסים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) ותורת FRET לצורך פירוש מדויק של הנתונים.
- תלוי במיקרוסקופ דו-פוטוני עם רזולוציה ספקטרלית, הכולל סבך העברה (transmission grating), EMCCD ויכולות כיול לייזר.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת תאים, פרוטוקולי תיוג ופרמטרי הדמיה כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר משמרים למערכות של תאי יונקים או תאי מקור, בשל הבדלים בביטוי ובדמיון.
- מוגבל על ידי הצורך בהתאמה אופטימלית של זוגות פלואורופורים והפרדה ספקטרלית כדי למנוע דליפה (bleed-through) במדידות FRET.
