סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

אחת המטרות החשובות ביותר במדעי המוח היא להבין את הרמזים המולקולריים המכוונים את השלבים המוקדמים של היווצרות סינפסות. לפיכך, הפך זה לדחוף לפתח גישות אובייקטיביות לכימות שינויים בקישוריות סינפטית. כדי לכמת את מספר הסינפסות במגוון של תכונות ניסיוניות, צובעים נוירונים בתרבית או תכונות של רקמת מוח שנחתכו בקירור (cryo section) באמצעות סמנים סלקטיביים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים כדי לסמן את נקודות המגע הסינפטי בין נוירונים.

לאחר מכן מדמיינים את התאים או הרקמה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ומשיגים תמונות ב-8 ביט עבור כל אחד מהערוצים המתאימים לשני הסממנים האימונוהיסטוכימיים. התמונות מנותחות באמצעות Image J 1.29 עם Puncta Analyzer. כדי לקבוע את מידת הקולוקליזציה (colocalization) בין הסממנים הפרה-סינפטיים לפוסט-סינפטיים, ניתן להשתמש בנקודות הקולוקליזציה כדי לקבוע את מספר הסינפסות הקיימות בדגימה.

היתרון המרכזי של הטכניקה המתוארת כאן על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, הוא שבדיקת הסינפסות מאפשרת ניתוח וכמותיות של מספר הסינפסות בסביבה גבוהה בהרבה. ההשלכות העיקריות של טכניקה זו פונות לעבר האבחנה והטיפול בהפרעות קליניות כגון מחלת אלצהיימר, אפילפסיה או אוטיזם, שבהן חריגויות בקישוריות סינפטית נחשבות לבסיס של הפתולוגיה העומדת בבסיסן. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות צורות של התערבות שיכולות להפחית או לשפר את הליקויים הנצפים ביכולתם של נוירונים מושפעים ליצור סינפסות זה עם זה.

למרות ששיטה זו שימושית לחקר התפתחות המוח, ניתן ליישמה גם באורגניזמי מודל או במערכות איברים אחרות שבהם תרצו לחקור או לכמת את מספר המגעים בין תאים, כאשר יש לכם את היכולת לסמן באופן סלקטיבי כל פני שטח מנוגדים של כל אתר מגע. הכינו תרביות נוירונים על ידי זריעה של תאי גנגליון רטינלי של חולדה, שפוּרפו מהרשתית של חולדה והופקו מבעלי גיל P5 עד P7, על כיסויי זכוכית מצופים ב-poly-D-lysine. בלוח עם 24 בארות, התאים יגודלו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלושה עד חמישה ימים לפני הטרנספקציה.

לאחר התעתוק (transfection), דגרו את התאים למשך שבעה עד שמונה ימים נוספים כדי לאפשר התפתחות סינפסים לאחר שהתאים שהוצבו בצלחות הבשילו מספיק. הסירו את מצע התרבית מהבארים והוסיפו 500 µL של 4% para formaldehyde שחומם מראש לכל באר, וקבעו את התאים למשך שבע דקות. לאחר הקיבוע, בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים שלוש פעמים עם phosphate buffered saline.

חשוב להבטיח שהתאים לא יתייבשו לעולם בתוך הבארות. ברגע שהסבון (buffer) מוסר מבארה, יש להחליפו מיד בסבון הבא. הכינו תמיסת חסימה (blocking buffer) המכילה 50% normal goat serum ו-0.2% Triton X 100.

לאחר הסרת ה-PBS מכל באער, הוסף 200 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל באער והמתן לחסימה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסת החסימה ושטוף שלוש פעמים. באמצעות PBS, הכן דילול של נוגדן ראשוני בתמיסה המורכבת מ-90% antibody buffer ו-10% NGS, המכילה את זוג הנוגדים הפרה- ופוסט-סינפטיים הנבחרים.

כאן נעשה שימוש ב-rabbit anti synapsin, סמן פרה-סינפטי, וב-mouse anti homer, סמן פוסט-סינפטי. סובב במרכז פוגה (Centrifuge) את דילול הנוגדן הראשוני במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגת שולחן כדי להסיר נוגדן ששקע, ולאחר מכן הוסף 200 µL של תמיסת נוגדן ראשוני לכל באר. הנח את הפלטה במכל לח כדי למנוע ייבוש של התמיסה הראשונית.

דגרו לילה שלם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני. שטפו כל באר שלוש פעמים. בעזרת PBS, הוסיפו 200 microliters של הנוגדנים המשניים המתאימים, המדוללים ביחס של 1:1000 בבופר נוגדים המכיל 10% NGS שהוכן מראש.

כמו קודם לכן, הניחו את הצלחת בתא הלחות והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחשכה לאחר ההדגרה עם הנוגדנים המשניים. שטפו כל באר שלוש עד ארבע פעמים ב-PBS. הניחו טיפה של מדיום קיבוע vector shield עם DPI על תיתורה של זכוכית.

לאחר מכן, הפכו את זכוכית הכיסוי עם התאים על גבי הטיפה לצורך קיבוע. לבסוף, מרחו לק שקוף מסביב לקצוות של זכוכית הכיסוי. הקפידו להימנע מהזזה או דחיפה של זכוכית הכיסוי במהלך המריחה.

כיוון שפעולה זו תסיר את התאים, הנח לסליידים להתייבש למשך 30 דקות לפחות במקום יבש וחשוך. בשלב זה, הדמיה מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה מסוג zes axio imager המצויד בסטים מתאימים של מסננים ובעדשת שיקוע בשמן של 63 פעמים. הנח על במה המיקרוסקופ סלייד המכיל תאים שאינם טרנספקטטיים.

השתמשו במערכת המסננים של ה-DPI כדי להדמיאן את גרעיני התאים, ובחרו תאים הנמצאים במרחק של לפחות שני קטרי תאים מהשכנים הקרובים אליהם. שימוש ב-DPI בשלב זה יסייע במניעת הטיות ויבטיח את אקראיות בחירת התאים. עבור כל תא שנבחר, השגיקו תמונות של שמונה ביטים באמצעות מערכות המסננים המתאימות, במקרה זה, GFP ו-Texas Red.

התמונה הצבועה-בדמה (pseudo colored) המולבשת צריכה להראות סמנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים באדום וב緑 בהתאמה. לאחר מכן, הניחו על במה של המיקרוסקופ שקופית המכילה תאים שעברו טרנספקציה. במקרה זה, התאים עברו טרנספקציה עם וקטור ביטוי של TD tomato.

השתמשו בסמן זה כדי לבחור תאים כפי שנעשה קודם לכן. עבור כל תא שנבחר, השגיעו שמונה תמונות של בורות (pits) באמצעות מערכות המסננים המתאימות במקרה זה, GFP, Texas Red ו-Sci five. בתמונה הצבעונית המדומה (pseudo colored image) המונחת אחת על השנייה, הסמנים הפוסט-סינפטיים צריכים להופיע בצבעי אדום, ירוק וכחול.

כאן, תוכנת ה-puncture analyzer משמשת לכימות של נקודות סינפטיות בעלות לוקליזציה משותפת. תוסף ה-Puncta analyzer נכתב על ידי Barry Walk וזמין לפי בקשה ב-image J 1.26. פתחו את אחת התמונות שנאספו.

השתמש בכלי הבחירה המעגלי כדי לבחור אזור בקוטר של תא אחד בקירוב, רדיאלית סביב ה-SOR הרלוונטי. כאשר אזור העניין נבחר, עבור לתפריט התוספים (plugins) ובחר ב-puncture analyzer. בחלון אפשרויות הניתוח שמופיע, בחר ב-Red Channel ו-Green Channel. ראשית, בצע הסרת רקע (subtract background) והגדר את קובץ התוצאות.

לחצו על אישור. לאחר מכן הגדירו מיקום לשמירת התוצאות. ניתן לייצא את התוצאות הללו ל-Excel לצורך ניתוח נוסף בחלון שיופיע.

בשלב הבא, ודאו שמתגדר רדיוס כדור מתגלגל (rolling ball radius) של 50 וביטלו את הסימון באפשרות הרקע הלבן. שינוי זה אינו הכרחי, אך הוא מועדף לעיתים קרובות על ידי משתמשי האפליקציה. לצורך ויזואליזציה נוחה, לחצו על אישור.

חלון חדש יופיע לצד מסכה התואמת לתמונת הערוץ האדום. התאם את הסף עד שהמסכה האדומה תתאים במידת המקסימום למספר הרב ביותר של נקבי דקירה בודדים ונפרדים. לחץ על "בוצע" (done), תוך הקפדה על מניעת רעש מוגבר.

הגדירו את גודל הפיסוק המינימלי לארבעה פיקסלים. אל תשנו דבר אחר. לחצו על אישור.

חזור על השלב הקודם, הפעם עבור הערוץ הירוק. לאחר חזרה על פעולה זו עם הערוץ הירוק, התוסף יספק כימות המתאים לנקודות (puncta) בכל ערוץ בנפרד, וכן לנקודות עם לוקליזציה משותפת (co localized puncta) בין שני הערוצים. את בדיקת הסינפסה המוצגת כאן ניתן להחיל על חתכי קריו (cryo sections) מהמוח ועל כל רקמה אחרת של מערכת העצבים, כגון חוט השדרה או הרשתית.

בתנאי שקיים זוג סמנים קדם- ופוסט-סינפטיים מתאימים. התחילו באיסוף רקמת מוח מעכבר שהורדם והורג על ידי דימום ושטוף ב-PBS. הניחו את המוח השלם ב-4%paraldehyde ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה, ועד ליום למחרת.

שטפו את המוח שלוש פעמים ב-PBS. בצעו הגנה קריוגנית למוח על ידי הנחתו ב-30% sucrose ב-PBS.

הרקמה תצוף בתחילה; יש לשמור אותה בטמפרטורה של 4°C עד שהרקמה תשקע לתחתית. בשלב זה, ההגנה הקריוגנית הושלמה. לאחר מכן, בתמיסה ביחס של שניים לאחד של 20% sucrose ל-OCT ו-PBS, יש להטמיע את המוח בכיוון הרצוי לצורך חיתוך.

לדוגמה, סגיטלי או קורונלי. לאחר מכן, הניחו משטח מתכת שטוח על גבי דלי עם קרח יבש. הניחו עליו את המוח הטמיע כדי להקפיאו. לאחר ההקפאה, העבירו את המוח לשקית הקפאה ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה לפני ביצוע החיתוכים.

באמצעות קריוסטט, חתכו את הרקמה לפרוסות בעובי 12 עד 16 מיקרון והניחו אותן על שקופיות זכוכית. לאחר מכן, ייבשו את השקופיות על ידי הנחתן בתנור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, שטפו אותן שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר שאריות OCT.

עט פראפין משמש ליצירת מחסום הידרופובי מסביב לזכוכית, ונוסיף לזכוכית תמיפת חסימה (blocking buffer) אשר נמנעת מזליגה מהזכוכית הודות לגבול הפראפין. הניחו את הזכוכית ב-20% normal goat serum ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לצורך חסימה, ולאחר מכן הניחו את החתכים בנוגדנים ראשוניים המדוללים ב-PBS עם 0.3% triton ו-10% normal goat serum.

כאן, נעשה שימוש ב-rabbit antit, PSD 95 כדי לסמן תאים פוסט-סינפטיים גלוטמטריים, וב-Guinea pig anti v glu two כדי לסמן טרמינלים פרה-סינפטיים גלוטמטריים. מקמו את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C והדגירו למשך 36 עד 60 שעות. לאחר ההדגרה, שטפו את הנוגדן הראשוני על ידי טבילה של השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 15 דקות בכל פעם.

לאחר שלב זה, יש לוודא שהסליידים מוגנים מאור ישיר. יש להוסיף נוגדנים משניים המדוללים ביחס של 1:200 ב-PBS עם 0.3% triton ו-10% normal goat serum. במקרה זה, goat anti Guinea pig.

נעשה שימוש ב-Alexa 488 ובנוגדן עז przeciw לארנב Alexa 594. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחשיכה.

שטוף את העגילות על ידי טבילה ארבע פעמים ב-PBS למשך 15 דקות בכל פעם לצורך הרכבה. הוסף טיפות קטנות של תווך הרכבה מסוג vector shield באמצעות dappy וכסה את העגילות בכיסויי זכוכית. מרח לק ציפורניים כדי למנוע תזוזות של כיסויי הזכוכית.

יש לבצע הדמיה של חתכי רקמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם לייזרים מתאימים, תוך שימוש בעדשת שמן 63x עבור כל תמונת חתך; יש לקחת חתכים אופטיים סדרתיים במרווחים של 0.33 micron לאורך עומק כולל של חמישה microns, לסך של 15 חתכים אופטיים. יש להדגים לפחות שלושה חתכים מכל חיה, ולכלול לפחות שלוש חיות מתנאי ניסוי נתון. יש ליצור השלכות בעוצמה מרבית (maximum intensity projections) מקבוצות של שלושה חתכים רצופים, כדי לקבל חמש השלכות המייצגות עומק של micron אחד כל אחת.

אלו נמדדו כמותית באמצעות Image J כפי שתואר עבור RG Cs עם ROI שונה כדי לקבוע את מספר הסינפסות שנוצרו בהיעדר אסטרוציטים. אימונוכימיה בוצעה על rgc מופרדים שטופלו במצע גידול בסיסי, תוך שימוש בנוגדנים נגד bassoon המופיעים באדום ונגד homer המופיעים בירוק כצפוי. נקודות סמיכות (colocalization) סינפטיות בודדות נצפו כדי לקבוע את השפעתם של מולקולות המופרשות על ידי אסטרוציטים על מספר הסינפסות שנוצרו; RG Cs מופרדים in vitro טופלו במצע מותנה של אסטרוציטים מעכבר מדי שלושה ימים למשך 12 ימים בסך הכל, לאחר הצביעה.

סינפסים רבים היו ניכרים בנוירון זה, אך soon מוצג באדום. Homer מוצג בירוק; RDCs מנותקים שעברו טרנספקציה עם Lee ציטופלזמי המבטא TD tomato טופלו במדיום צמיחה בסיסי בלבד. סינפסים אינם נראים.

עגבניית TD נראית בכחול והסינפסה נראית באדום. נראה אות חלש מאוד עבור הסמן הפוסט-סינפטי homer המוצג בירוק. כאשר אותם תאים מטופלים באופן כרוני במצע מותנה של אסטרוציטים של חולדה, נראים סינפסות רבות.

כאן מופיע TD tomato בכחול, synapsin באדום, ו-homer בירוק. מוצג RGC מטוהר שעובד עם מצע מותנה של אסטרוไซต์ ונצבע לסמני pre synapse באדום וסמני post-synaptic homer בירוק. מסיכות סף שנוצרו באמצעות puncture analyzer תואמים לשני הערוצים הקיימים. לאחר זיהוי נקודות של קולוקליזציה, Puncta analyzer מפיק ייצוג גרפי של נקודות אלו.

מנתח ה-puncta מספק פלט מספרי המציין את מספר ה-puncta הבודדים שזוהו בשני הערוצים ועבור נקודות של קולוקליזציה. הנתונים שהופקו מניתוח נוירון זה מדגימים את היכולת של מולקולות המופרשות על ידי אסטרוציטים לקדם היווצרות סינפסים, המוצגת כאן כבדיקת סינפסים שבה נמדדה קולוקליזציה של סימון אימונוהיסטוכימי פרה- ופוסט-סינפטי כדי להוכיח את ההגברה של היווצרות סינפסים המושרה על ידי אסטרוציטים באמצעות ביטוי יתר של הרצפטור הנוירונלי למולקולה הסינפטוגנית החשובה המופרשת על ידי אסטרוציטים, thrombo spon. באיור זה מוצג המספר הממוצע של סינפסים לנוירון שטופל באופן כרוני במצע גידול בסיסי, gm, או במצע המעשיר באסטרוציטים (astrocyte conditioned media).

A-C-M-A-C-M מקדם בעוצמה רבה יותר את היווצרות הסינפסות בתאי גנגליון ברשתית המבטאים באופן יתר את קולטן ה-thrombospondin בהשוואה לתאים המבטאים באופן יתר וקטור ריק. כדי לכמת את הצפיפות הסינפטית ב-superior colliculus של עכבר, תאים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים סומנו בנפרד באמצעות סממנים אימונוהיסטוכימיים ספציפיים למדור. כפי שמוצג כאן, חלה עלייה במספר הסינפסות מהיום השביעי לאחר הלידה ועד ל-P 14.

סרטון זה מדגים את העלייה במספר הסינפסות ב-superior colliculus במהלך חלון זמן התפתחותי זה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים פרוטוקול זה בכשני ימים עבור תרביות נוירונים מופרדות (dissociated), ובכחמישה ימים עבור חתכי מוח המופקים מהבעל לאחר ביצוע הליך זה. שיטות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה אלקטרונית, משמשות כדי לוודא שהשינויים במספר הסינפסות משקפים שינויים בסינפסות פונקציונליות ובסינפסות תקינות מבחינה אולטרה-מבנית, בהתאמה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליישם אימונוהיסטוכימיה על הדגימה הניסויית שלכם כדי לכמת את מספר הסינפסים. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשתמש בנוגדנים ספציפיים למדורים כדי לסמן באופן סלקטיבי את המדורים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים. בהקשר זה, אנו מגדירים סינפסים כנקודות של קולוקליזציה בין האותים המתקבלים מכל אחד מהמרקרים הללו.