פרמקולוגיה ההתנהגות של התניה קלאסית תגובת הרחבה חוטם ב דבורי דבש ( אפיס מליפרה)

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את המכניזמים המולקולריים העומדים בבסיס הלמידה ויצירת הזיכרון. בדבורי דבש, השלב הראשון הוא איסוף דבורים מעופפות באופן חופשי מהכו שלהן. לאחר מכן, הדבורים נרתמות לצינורות פלסטיק.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע התניה קלאסית. ניתן להזריק תרופות בנקודות זמן מסוימות סביב ההתניה כדי לבחון את השפעתן על הלמידה ועל יצירת הזיכרון. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא בדיקת שימור הזיכרון.

בסופו של דבר, שינויים בהתנהגות לאחר טיפול תרופתי עשויים לחשוף את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הלמידה ויצירת הזיכרון בדבורי דבש. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הלמידה והזיכרון על ידי חשיפת המנגנונים המולקולריים של יצירת הזיכרון.

באופן כללי, חוקרים שאינם בקיאים בשיטה זו ייתקלו בקשיים כיוון שתזמון הצגת הגירויים במהלך ההתניה ואחזור הזיכרון חייב להיות מדויק. כמו כן, משטר ההאכלה הוא קריטי. הפרוצדורה תודגם על ידי cutting gearing ו-Johannes faberg לסטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. ביום שלפני הניסוי, אספו דבורים בין השעות 14:00 ל-16:00 באמצעות פירמידת פרספקס חדירה לאור UV.

עם החזרה למעבדה, הניחו את הפירמידה על בסיסה וכסו את הקירות במגבת, תוך השארת קודקוד הפירמידה חשוף. פתחו את הקודקוד והחזיקו מבחנה מזכוכית מעל הפתח, אפשרו לדבורה אחת להיכנס למבחנה ולאחר מכן סגרו אותה שוב. המשיכו בתהליך זה עד שכל הדבורים יועברו למבחנה מזכוכית בעונת הסתיו והחורף.

כאשר הדבורים אינן עפות בחוץ, כוורת נשמרת בתוך חממה בתוך רשת, ודבורים בודדות נתפסות ישירות מהרשת. באמצעות מבחנה אחת לכל דבורה, קבע את הדבורה על ידי קירור המבחנה על קרח למשך שתיים וחצי עד שלוש וחצי דקות. עקוב אחר הדבורה בקפידה והוצא אותה מהקרח ברגע שהיא מפסיקה לזוז.

קבעו את הדבורה המורדמת בתוך מבחנה פלסטית קטנה באמצעות סרט דביק. ודאו כי הדבורה מסוגלת להניע את ה-osis בחופשיות, אך לא את ראשה, חזהה או רגליה. חשוב מאוד שלא לדחוס את הצוואר.

לאחר הכנת הדבורה, מקמו את המבחנה בחור ממוספר על גבי מעמד, לצורך טיפול וזיהוי יעילים יותר.

השפופרות תמיד מוחזרות לאותו קידוח. לאחר הטיפול, יש להאכיל את הדבורים בין השעה 16:00 ל-18:00 במיקום הנפרד מאתר ההרגלה. עוררו את תגובת פריסת החרטום (Proboscis extension response או PER) על ידי נגיעה בדבורים ובממששים.

בעזרת תמיסת סוכרוז, אפשרו לדבורה לצרוך טיפה אחת של כ-4 µL מתמיסת ה-SRAs. ודאו שאינכם ממרחים על מחושיה של הדבורה, על הפרובוס (proboscis) או על השפופרת הפלסטית. האכילו כל דבורה עד שלא תרצה להמשיך.

הדגם תגובת רפלקס להרחקה (PER) מהירה ואמינה כאשר מגעו של התמיסון באנטנות. בערבים הבאים של הניסוי, האכיל כל דבורה ארבע פעמים בטיפה אחת של תמיסות סוכרוז. מלא קערת פלסטיק בגובה של כ-0.5 עד סנטימטר אחד במי ברז.

הניחו את מתקן הדבורים הרתומות בתוך הקערה, תוך שימוש בצלחות lysa כפלטפורמה. כסו את הקערה בקרטון ואחסנו בטמפרטורת החדר למשך לילה. הדבורים יעברו התנייה ריחית בסביבות השעה 10:00 בבוקר, למחרת האיסוף.

30 דקות לפני תחילת הניסוי. מקמו את מתקן הדבורים הרתומות ליד אתר ההתניה, אך הרחק מפתח צינור הפליטה שבו יאומנו הדבורים. לאחר מכן, הכינו את גירוי ההתניה תוך עבודה במנדף.

השתמשו בטיפ עם מסנן כדי להעביר ארבעה µL של שמן ציפורן אל נייר סינון עגול. הניחו את נייר הסינון המבושם בתוך מזרק של 20 mL והכניסו את הבוכנה. הגדירו את נגן השמע שיספק אות אקוסטי לנסיין.

דבר זה מבטיח תזמון מדויק של הגירוי, תחילת הגירוי, סיום הגירוי, משכו ומיקומו. היערכו להקלטת התנהגות הדבורה לאורך כל תהליך ההתנייה. ציון חיובי יינתן אם הדבורה פורסת את ה-SSIS שלה בין תחילת גירוי ההתנייה לבין הצגת הגירוי הבלתי מותנה.

חצייה של קו וירטואלי בין המנדיבולים הפתוחים. כדי להתחיל ניסוי רכישה, בחרו את הדבורה לאימון והציבו אותה מול פתח הפליטה למשך 10 שניות. זמן קצר לפני סיום פרק זמן זה של עשר שניות, מקמו את המזרק המכיל את הריח במרחק של שלושה סנטימטרים מהדבורה וממששיה. הגישו את הריח לאורך חמש שניות על ידי דחיפת 20 milliliters של אוויר דרך המזרק.

לאחר שלוש שניות, יש להחדיר את הגירוי הבלתי מותנה על ידי נגיעה בחלק הוונטרלי של השוטים הדיסטליים של שתי האנטנות באמצעות קיסם רטוב בתמיסת סוכרוז. תוך הקפדה שלא להשליט תמיסה על הדבורים והאנטנות, יש לאפשר לדבורה ללקק את הקיסם. גירוי משולב זה נמשך ארבע שניות, לאחר מכן הדבורים מוסרות מהקשר האימון ומוחזרות למדף.

13 שניות לאחר הצגת הגירוי המותנה, נמשך כל ניסוי אימון במשך 28 שניות. החזירו את הדבורה לאתר האימון לאחר מרווח של 10 דקות בין הניסיונות. בצעו את הניסוי השני מתוך שלושה כפי שהודגם קודם לכן, והמתינו 10 דקות נוספות לפני ביצוע ההצמדה הסופית.

לאחר השלמת האימון להיום, החזירו את המדפים אל הקערה. זכרו להאכיל כל דבורה ארבע פעמים בטיפה אחת של 4 µL של תמיסת סוכרוז בין השעה 16:00 ל-18:00. כפי שהודגם קודם לכן, ניתן לבצע מבחני שימור (retention tests) בכל מרווח זמן, מדקות ועד ימים לאחר האימון. התכוננו למבחן הזיכרון על ידי הצבת מדף הדבורים בקרבת אתר ההתניה למשך 30 דקות.

התחילו את הבדיקה על ידי הנחת דבורה לפני פתח הפליטה למשך 10 שניות. הציגו את גירוי התנאי למשך חמש שניות ורשמו את התרחשות ה-PER. לאחר סיום הבדיקות להיום, החזירו את המדפים אל הקערה.

זכרו להאכיל כל דבורה ארבע פעמים בטיפה אחת של 4 µL של תמיסת סוכרוז בין השעה 16:00 ל-18:00 כפי שהודגם קודם לכן; בסיום הניסוי כולו, ודאו שהדבורה עדיין מסוגלת להושיט את ה-proboscis על ידי נגיעה באנטנה עם תמיסת SRAs כדי שתכלול בניתוח; על הדבורים לשרוד את כל הניסוי ולהחזיק ב-PER תקין. בחלק מהמחקרים, נעשה שימוש בהזרקות סיסטמיות כדי לבחון את ההשפעה של התערבויות פרמקולוגיות על זיכרון ריח. ניתן לבצע הזרקות אלו בזמנים שונים, בהתאם לתכנון הניסוי.

כדי להתחיל, צרו חור קטן בקוטיקולה של החלק האחורי של ה-S scootin ליד הסדק של ה-S scootle מעל שריר התעופה, באמצעות מחט היפודרמית חד-פעמית. לאחר מכן, מלאו צינור קפילרי מזכוכית ב-1 µL מהתמיסה לבדיקה. הכניסו את הקפילרה אל החור בקוטיקולה והזריקו את התמיסה אל שריר התעופה.

נסיינים מיומנים מסוגלים להזריק B אחד מדי 30 שניות, דבר המאפשר תזמון מדויק של ההזרקה וההתנייה. כאן מוצגים שני ניסויים. הניסוי הראשון בוחן את ההשפעה של הזרקה סיסטמית של תמיסת מלח (saline) שניתנה לפני האימון על למידת זיכרון.

במחקר זה קיימות שלוש קבוצות: קבוצה A שאינה מקבלת טיפול, קבוצה המקבלת הזרקה סיסטמית של 1 µL של phosphate buffered saline, או קבוצת דמה (sham). טיפולים אלו ניתן 30 דקות לפני האימון המוצג כאן משמאל. אחוז בעלי החיים שהפגינו את התגובה המותנית במהלך שלב הרכישה עלה לאורך שלושת ניסיונות האימון, ללא הבדלים בין הקבוצות.

גרפי העמודות מימין מראים כי לא הזרקת ה-PBS ולא הפגיעה המדומה (sham lesion) השפיעו על שימור הזיכרון. 24 שעות לאחר האימון בניסוי השני, ניתנו הזרקות 40 דקות לאחר האימון; הדבורים חולקו לקבוצה אחת שקיבלה תמיסת מלח ולקבוצה שנייה שקיבלה מיקרוליטר אחד של מעכב סינתזת חלבונים, anisomycin. גרפי העמודות מימין מראים ירידה ברורה בשימור הזיכרון בדבורים שקיבלו anisomycin. תוצאות אלו מדגישות את חשיבות סינתזת החלבונים ביצירת זיכרון ריח.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון מהו הבסיס הנוירופיזיולוגי של למידה ויצירת זיכרון לאחר התפתחותם? טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקרי הלמידה והזיכרון לחקור את המנגנונים המולקולריים והנוירופיזיולוגיים ביצירת זיכרון בדבורת הדבש.