אגר-Block מיקרוקוסמוס של פירוק רקמות הצמח מבוקרת על ידי פטריות אירובית
3 בפברואר 2011
וידאו זה מדגים גישה בסביבה מבוקרת ללמוד השפלה של רקמות הצמח lignocellulosic ידי פטריות אירובית. היכולת לשלוט במקורות מזין לחות היא יתרון המפתח של אגר, לחסום מיקרוקוסמוס, אך הגישה לרוב מניב הצלחה מעורבת. אנו כתובת החסרונות קריטי תשואה לשחזור, השתנות נמוך התוצאות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להחדיר פטרייה אירובית מפרקת עץ למיקרוקוסמוס בצלחת פטרי, שבו לחות העץ ותשתי העשיר (exogenous substrates) נמצאים תחת בקרה הדוקה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת מיקרוקוסמוסים עם נפחים מדויקים של מצעים ידועים. לאחר מכן, העץ המיועד לפירוק וכל תשתית מוצקה חיצונית מונחים מעל רשת פלסטיק על פני השטח של האגאר, מבלי לאפשר מגע בין התשתיות.
לאחר מכן מחדירים למיקרוקוסמוס את הפטריית הבדיקה ומדגירים אותו. עם סיום הדגירה, קוצרים את גושי העץ כדי לקבוע את אובדן המסה ולהכין רקמות לצורך אנליזות. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות את מידת הביודגראדציה של העץ ואת תפקידם של מקורות אלמנטים חיצוניים באמצעות מדידות אובדן מסה, תצפיות על מורפולוגיית המיצליום ואנליזות אלמנטריות ממוקדות, כגון ספקטרוסקופיה של פלזמה מצומדת השראיתית (ICP).
שלום, שמי ברוק ג'ייקובסון מהמעבדה של ד"ר ג'ונתן שילינג במחלקה להנדסת ביו-מוצרים ומערכות ביולוגיות באוניברסיטת מינסוטה. היום נראה לכם פרוצדורה לשימוש בצלחות פטרי כמיקרו-סביבות לפירוק רקמת צמחים על ידי פטריות אירוביות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את מנגנוני פירוק הליגנוצלולוז על ידי פטריות.
ליגנוצלולוז הוא רקמה צמחית המורכבת מליגנין, תאית והמיצלולוז. הרקמה אותה אנו לומדים לעיתים קרובות ביותר היא עץ; טעויות בהיבטים הפחות טכניים של תכנון בלוק המקדח הן הגורמים השכיחים ביותר לכישלון ומקורות מרכזיים לשונות בין מחקרים, מה שהופך את פרסום הסרטון של מערך בלוק המקדח שלנו למועיל. אנו יודעים מניסיון שפרוצדורה זו מניבה תוצאות באיכות גבוהה עם שונות נמוכה.
אם כן, נתחיל. עבור ניסויים אלו, השתמשו בצלחות פטרי העמוקות בסנטימטר אחד יותר מצלחות פטרי טיפוסיות, כדי להגדיל את המרווח מעל גוש העץ במיקרוקוסמוס.
התחילו את הכנת המיקרוקוסמוס על ידי הכנת כמות מספיקה של מדיום עבור 20 מיליליטר לכל צלחת פטרי, ללא סידן וברזל. הוסיפו אגר בריכוז של 15 גרם אגר לבקבוק מדידה של 500 מיליליטר המכיל בערך 400 מיליליטר של מים דה-יוניים תומחים בתוספים. השתמשו בתמיסות מלאי שהוכנו מראש כדי להוסיף מיקרו-נוטריאנטים לתערובת.
לאחר הוספת חומרי ההזנה, מלאו את הבקרה הנפחית עד לקו ה-500 milliliter. לאחר מכן, העבירו את המצע לבקרה של 1000 milliliter. בצעו עיקור באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 degrees Celsius ובלחץ של 16 PSI למשך 20 דקות.
הקפידו שלא לעבור נפח של 500 milliliters לכל בקבוק כדי למנוע את התגבשות ה-agri לפני הגשת פלטות הבדיקה. לאחר האוטוקלאב, המתינו עד שהמצע יתקרר למגע כדי למזער עיבוי. מזעור הלחות הוא קריטי בניסויים אלה, כפי שמוגדר כתכולת לחות או mc.
מעל 80% יגרמו לאנוקסיה ברקמות. הגבילו את הריקבון על ידי פטריות אירוביות והגבירו את השונות פעם אחת. קררו. השתמשו בעזר פיפטה נייד ובפיפטות פוליסטירן סטריליות של 10 milliliter כדי לבצע את הפעולה באופן אספטי.
העבירו את האגר לערימה גבוהה של צלחות בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית. לאחר מכן, גזרו בנדיבות רשתות פלסטיק שיתאימו לתחתית הצלחות. לאחר הגזירה ושטיפה יסודית של הרשתות במים וסבון, הכינו את רשתות הפלסטיק לייבוש ולאוטוקלאב לצורך הדגמה זו.
אותריח צהוב דרומי (Southern yellow pine או SYP) משמש במחקר זה כיוון שהוא מהווה מקור חשוב לעץ למסחר. בבנייה למגורים בארה"ב, השתמש בעץ שאינו מטופל וחתוך בלוקים נטולי קשרים בגודל 19 על 19 מילימטר מחיתוך א अनुדריך אחד לאורך הסיב. חתוך אורך זה לבלוקים של 19 מילימטר מעקוב.
חלקו את הבלוקים בגודל 19 מילימטר מעקב בחצייה לאורך הסיבים באמצעות פסול ופטיש במקום מסור. פעולה זו תיצור קצה בלוק מחוספס שיהיה פונה כלפי מטה אל הרשת הפלסטית במיקרוקוסם של בלוק החקלאות, וקצה עליון חלק לסימון. סמנו את הקצה החלק של הבלוקים בעזרת עיפרון, חתכו מספיק בלוקים עבור הטיפולים, וכן עבור הביקורות ללא ההדבקה שישמשו הן כניטורים לזיהום והן כדגימות נתוני בסיס שיעברו התנייה במקביל עבור חומר מיובש בתנור; הניחו את הדגימות בתבניות גבינה מאלומיניום והכניסו לתנור קונבקציה בטמפרטורה של 100 degrees Celsius למשך 48 שעות.
העבירו את הדגימות מהתנור למ desiccator לקירור. שקלו את הדגימות מראש כדי לקבוע את המשקל הראשוני לאחר ייבוש בתנור. לבסוף, הכינו את הדגימות, כולל רשתות פלסטיק ועץ, לאוטוקלאב על ידי עטוףה הדוקה בנייר כסף כדי למזער את ההרטבה.
אין צורך לעטוף כל דגימה בנפרד, אך יש לוודא שהחשיפה לקיטור היא נמוכה ועקבית. בצעו אוטוקלב לדגימות המסומנות ב-121 degrees Celsius וב-16 PSI למשך שעה אחת. בתוך קבבית בטיחות ביולוגית סטרילית, הכינו AEs ריקים, פלטת מקור עבור תשתית צמחים רשתית של אינוקולום (inoculum), חומרים אקסוגניים, טוש Sharpie, רצועות פאראפורם, פינצטה וכלי העברה.
השלב הבא של ההחדרה הוא הוספת הפריטים לצלחוני פטרי סטריליים כדי להקטין את הסיכון לזיהום. עטרו את כלי ההעברה והפינצטות בלהבה או ב-95% ethanol בעת השימוש בהם. ראשית, הוסיפו את רשת הפלסטיק לצלחון הפטרי.
לאחר מכן, הוסיפו כאן את מצע העץ. שני בלוקי עץ מתווספים לאורך הרשת כדי שניתן יהיה להจับ נתונים מלקטים מוקדמים ומאוחרים. בלוקים אלו מתווספים זה לצד זה, כאשר הסיבים פונים לעבר מקור התוסיף הפטרייתי.
בשלב הבא, הוסיפו את החומרים החיצוניים. כאן, נבחן את תפקידו של הגבס בתהליך הריקבון שנגרם על ידי פטרייה סיפית. לכן, על הפטרייה להיתקל בדיסקיות הגבס הללו לפני הגעתה לעץ.
דיסקית גבס אחת מתווספת בין כל בלוק לנקודת接 inoculation בחלק העליון של הרשת. יש להקפיד על מניעת מגע בין הדיסקיות בתוך העץ, תוך שמירה על קרבה ביניהן. עבור התמצית הפטרייתית, השתמשו במקדח שעם מספר 4 בעלת קוטר של 7 מילימטר כדי להכין פלאגים מתרביותיות בנות שבועיים שגדלו ב-20 milliliters של agar.
פעולה זו מסייעת לשלוט בנפח התוסיף. עבור ביקורות ללא תוסיף, מומלץ להוסיף פקק מתוך צלחת סטרילית. אין לאפשר מגע בין התוסיף לבין התשתיות החיצוניות או העץ, אך יש להניחם קרוב זה לזה.
השתמשו בתקע הinoculum אחד לכל בלוק. אטמו את הצלחות באמצעות param שנגזר בסכין גילוח; החזיקו את הפלטות במצב אופקי ועטפו את ה-param בתנועה חלקה ורציפה. לבסוף, סמנו את מכסיי הצלחות באמצעות מרקר עמיד לאלכוהול, כאשר מספרי הבלוקים מסומנים ישירות מעל לתשתיות המתאימות.
שרטטו גם עיגולים מעל דיסקיות הגבס. העבירו את הפלטות בזהירות לאנקובטור ביולוגי כדי למנוע ניעור של התכנים ולצמצם קונדנסציה עקב תנודות בטמפרטורה. התנאים המשמשים כאן הם 20 °C ובחושך; בצעו איסופים של סדרות זמן באופן אספטי, למעט באיסוף האחרון.
בנקודת הקציר של השבוע החמישי, הוצא את כל מנת הטיפול. רסס כל צד תחתון ועליון ב-70% ethanol והשתמש בפינצטה שעברה עיקור בלהבה כדי להוציא חומר בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. צלם תמונות לפני השמדת צלחות הגידול (agri plates), תוך התמקדות בכל morph F או במלון.
לאחר מכן הוצא את הבלוקים המיועדים לטיפול. גלל הלאה עודפי pha, אך היזהר לא לאבד חומר רקוב בתהליך. ייבש את הבלוקים בתבניות אלומיניום וקבע את אובדן המסה באמצעות המשקלים הרטובים והיבשים של הביקורות כדי לנטר ספיגה מוגברת.
נתוני איבוד מסה מסייעים להערכת התקדמות הריקבון ומהווים נתונים חשובים. אם יש לחשב ריכוזים של יסודות על בסיס משקל בגרמים, יש לנרמל את נתוני האחוזים. לצורכי סטטיסטיקה, סמנו ועקבו אחר כל הבלוקים בעלי גוון חום כהה, שרוויים בבירור במים.
לבסוף השמידו את התרביות בשקיות המתאימות לאוטוקלאב, תוך שמירה על רשת התמיכה מפלסטיק וכל רכיב אחר שניתן למחזר לשימוש בניסויים עתידיים. בשימוש במערך המיקרוקוסמוס של בלוקי חקלאות (agri block), בלוקי עץ אורן מונחים על רשת פלסטיק כדי להגביה את הבלוקים מעל מגע החקלאות. פטריות Crains מעגליות גדלו במגע ישיר עם משטחי הגבס ובתוך בלוקי העץ.
מיצליום זה מייצג קשר חשוב בין עץ לבין מקורות חיצוניים של רכיבי תזונה. שליטה במקורות החומרים החיצוניים הללו באגר או בחומרים מוצקים היא יתרון מרכזי של תכנון בלוקי חקלאיים לעומת תכנון בלוקים של קרקע. כאן מוצגת אובדן המשקל הממוצע באחוזים כמדד להיקף ריקבון העץ על ידי ser crain's לאחר חמישה ו-15 שבועות של אינקובציה עם אורן במיקרוקוסמים של בלוקים חקלאיים.
לא בוצעו טיפולים. התווסף סידן כלוריד בריכוז Five millimolar לאגר עם גבס בטוהר של יותר מ-99% או גבס מועשר ב-1% iron; עבור כל קציר, עמודות תחת אותה אות אינן שונות באופן מובהק. כאשר פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן, נצפתה הפסד משקל של יותר מ-60% בבלוקים של אורן עם ריקבון חום בקבוצת הביקורת, נתון העומד ביעד התקן של ה-American Society for Testing and Materials לריקבון של יותר מ-50%.
מקדם השונות הממוצע של הריקבון היה 0.055 בשבוע 16. בנוסף לשונות נמוכה, נצפה אפקט טיפולי. ריקבון פטרייתי נבלם באמצעות תוספות סידן, בין אם הוספו לאגר כסידן כלורי או כגבס טהור.
באופן מעניין, שיעורי הריקבון התאוששו עם הוספת ברזל לגבס. הדבר מרמז כי ברזל, ולא סידן, הוא הגורם הקריטי בתצפיות על חמשת החזרות בשבוע ה-15 של הריקבון. בבדיקת פטריית ריקבון חום דומה, למינאות מעגליות, צבע המיצליום חושף את המהות.
הבדלים בהיפים חיצוניים בין הטיפולים; הבלוקים הוסרו ויובשו. הדבר חשף את המחסור במיצין בטיפול נטול סידן. ההצהבה בטיפולי סידן טהור והמראה החלוד בטיפול עם תוספת ברזל.
הביקורת מייצגת בלוקים שלא הוכנסו פטריות לצורך השוואה. באופן מעניין, ההשפעות המרכזיות הולכות לאיבודים בשימוש במצע עשיר בברזל. יחד, הדבר מרמז כי פטרייה זו מנצלת ברזל, ולא סידן.
בחומרים אלו, הצגנו כיצד להשתמש במערך בלוקי קידוח (auger block) כדי לבחון בהצלחה את הbiodegradation של רקמות צמחים על ידי פטריות חוטיות אירוביות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למנוע מגע בין התשתיות, ובמיוחד בין רקמת הצמח לקידוח, למזער את תכולת הלחות מהקידוח ומהפלטות, ולוודא שוב שתוכנן של כל פלטה לא זז לפני האינקובציה. כאשר לוקחים משתנים אלו בחשבון, ניתן לשלוט בסביבת הריקבון בצורה טובה הרבה יותר מאשר בשימוש במערך בלוקי קרקע.
ניתן להפיק נתונים עם עוצמה סטטיסטית הדרושה למענה על שאלות המחקר שלכם. זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים גישה של סביבה מבוקרת לחקר פירוק של רקמות צמחים ליגנוצלולוזיות על ידי פטריות אירוביות. השיטה כוללת בקרה הדוקה של לחות העץ ומצעים חיצוניים כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אקולוגיה מיקרוביאלית
- ביולוגיה של פטריות
- תהליכי ביודגדרציה
רקע
- מיקרוקוסמוים של בלוקי אגר מאפשרים מחקרים מבוקרים של פירוק עץ.
- הבנת תפקידם של פטריות אירוביות בפירוק ליגנוצלולוזית היא קריטית ליישומים אקולוגיים ותעשייתיים.
- במחקרים קודמים צוינו קשיים בהשגת תוצאות עקביות.
- מחקר זה נותן מענה לאתגרים אלו במטרה לשפר את השחזוריות.
מטרת המחקר
- להוחדר פטרייה אירובית מפרקת עץ במיקרוקוסמוס מבוקר.
- למדוד את דרגת הביודגרדציה של העץ.
- לנתח את השפעתם של סובסטראטים חיצוניים על הפירוק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מיקרוקוסמוסים עם נפחים ספציפיים של מדיה.
- הרכבת עץ ותשתיות על גבי רשת פלסטית.
- הדבקה ואינקובציה עם הפטרייה הנבדקת.
- קציר של חתיכות עץ לצורך ניתוח אובדן מסה וניתוח רקמות.
תוצאות עיקריות
- מדידות של איבוד מסה מעידות על מידת הפירוק הביולוגי של העץ.
- תצפיות על מורפולוגיית המיצליום מספקות תובנות לגבי הפעילות הפטרייתית.
- ניתוחים אלמנטליים חושפים את השפעתם של מקורות חיצוניים על הפירוק.
- התוצאות מדגימות את יעילותה של גישת המיקרוקוסמוס המבוקרת.
מסקנות
- הסביבה המבוקרת משפרת את השחזור במחקרי ביודגרדציה.
- הבנת תפקידם של חומרי תזונה ולחות היא קריטית למחקרים עתידיים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים שונים העוסקים בפירוק עץ על ידי פטריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוקוסמוסים מבוקרים של בלוקי אגר מאפשרים בחינה מדויקת של פירוק רקמות צמחים המונע על ידי פטריות, ובכך הם מסייעים בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים של תהליכים ביולוגיים. גישה זו נותנת מענה לשונות ולהגבלות בבקרת רכיבי תזונה הגלומות בשיטות של בלוקי קרקע, ובכך היא מגבירה את הביטחון החזוי עבור מחקר ופיתוח בביופארמה המכוון לפירוק ליגנוצלולוסי. השחזוריות של השיטה ותוצריה הכמותיים מציבים אותה ככלי יסודי לקידום פיתוחים במחקר בתחומי הביו-אנרגיה והביורמדיאציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה קפדנית של מנגנוני פטריות בפירוק ליגנוסלולוז תחת תנאי תזונה מוגדרים.
- תומך בתיקוף תפקודי של זני פטריות או אנזימים לצורך פיתוח ביו-תהליכים.
- מסייע בהסרת סיכונים מנגנוניים על ידי בידוד השפעות של משתנים חיצוניים על קצבי הריקבון.
- מספק נתוני אובדן מסה ונתונים אלמנטריים כמותיים לצורך בחירת מטרות מונחית-השערות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מיקרוקוסמוים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך סריקה השוואתית של פעילות פטרייתית.
- מייצר מדדי ריקבון כמותיים המתאימים לאופטימיזציה של בדיקות ולביצוע השוואות (benchmarking).
- מאפשר הערכה שיטתית של השפעות חומרי הזנה או תוספים על ביצועי הפטריות.
- תומך ביכולת הרחבה של הפלטפורמה ובניתני השוואה בין מחקרים באמצעות תנאים מבוקרים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתואם עם יעדים תרגומיים בתחומי הביו-אנרגיה והביו-סנניציה (bioremediation) באמצעות מידול של תהליכי פירוק רלוונטיים לתעשייה.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של זני פטריות או ביו-קטליזטורים.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי הבטחת שחזור בשלבים מוקדמים ובהירות מכניסטית.
שילוב תהליכים וסבבי עבודה
שיטת המיקרוקוסמוס של בלוקי אגר זו משלבת בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת בפיתוח בדיקות המשך ובמחקר תרגומי בביוטכנולוגיה פטרייתית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על השפעות תזונתיות ומנגנוני ריקבון פטרייתיים באמצעות בידוד מבוקר של משתנים.
- סריקה: מספקת תוצרי אובדן מסה ואלמנטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח מערכי בדיקה חסונים.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של טיפולים באמצעות אובדן מסה, מורפולוגיה של המיצליום ואנליזה אלמנטרית.
- מחקר תרגומי: ממדלת תרחישי פירוק רלוונטיים לתעשייה לצורך הערכה פרה-קלינית של מועמדים פטרייתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה למחקרים מכניסטיים ומחקרי סריקה חוזרים לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי פירוק פטרייתי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבת קנה המידה של זרימות עבודה ניסיוניות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת תהליכים (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי מזעור השונות הניסיונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים לביופרוצסים פטרייתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של פטריות, בטכניקה אספטית ובהרכבת מיקרוקוסמוס.
- דורש גישה לדגירה מבוקרת, למאזניים אנליטיים ולמכשור לניתוח אלמנטרי.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להקמת המיקרוקוסמוס ולנרמול נתונים.
- ניתן להתאמה לרקמות צמחים ולזני פטריות שונים באמצעות שינויים בפרוטוקול לפי הצורך.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לבקרת לחות ופוטנציאל לשונות במגע עם התשתית.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Introduction
1:49
Microcosm Preparation
4:16
Preparation of 'Block' Substrates
5:49
Inoculating and Labeling
11:47
Conclusion
8:02
Incubating and Harvesting
9:33
Representative Results for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi using Agar-block Microcosms
