פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנטר באופן לא פולשני שינויים מטבוליים בזמן אמת ברמת החיה השלמה בתוך הגליקוליזה, מטבוליזם של פירובט ומחזור חומצה הטריקרבוקסילית, הנגרמים על ידי מסלול מטבולי בודד, שינויים גנטיים ו/או טיפולים פרמקולוגיים. מטרה זו מושגת על ידי הזנה של איזוטופים יציבים לנמטודות חיות כדי לספק העשרה איזוטופית מספקת במספר מטבוליטים, המאפשרת כימות של שינויים גנטיים ו/או פרמקולוגיים במסלולים מטבוליים ביניים. כשלב שני, השילוב האיזוטופי בפחמן דו-חמצני אטמוספירי ובפחמן דו-חמצני מומס נמדד באמצעות ספקטרומטריית מסות של יחסי גזים, המספקת הערכה ישירה יותר של שטף מטבולי של ביניים לאורך פרקי זמן קצרים.

הדגימות הבאות מעובדות לניתוח חומצות אמינו חופשיות בתולעת שלמה באמצעות HPLC, וכן להעשרה איזוטופית בחומצות אמינו ובחומצות אורגניות באמצעות GCMS, וזאת כדי לכמת שינויים בשבב המטבולי (metabolic flux) בנמטודות. בעקבות חשיפה לאיזוטופים יציבים, התקבלו תוצאות המראות השפעות של משכי חשיפה משתנים לאיזוטופים, ניקוי חיידקים ושיטות חלופיות לפירוק התולעת בתולעים מסוג wild type, על מנת לבחון את השפעות האיזוטופית במטבוליטים ביניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המטבוליזם של תוצרי ביניים.

ניתן להחיל זאת גם על מערכות שלנו, כגון קווי תאים של יונקים ורקמות. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבחנו בחריגויות עקביות בניתוח חומצות אמינו חופשיות בתולעים באמצעות HPLC, אשר העידו על פגיעה בזרימה המטבולית הביניים בתפקודי שינויים נשימתיים ראשוניים. כדי להתחיל את ההליך הזה.

תולעים שנחשפו למקדימה מטבולית המסומנת באיזוטופ יציב, בין אם במהלך ההתפתחות ובין אם בבגרות, נאספות לשפופרת צנטריפוגה פלסטית בנפח 1.5 milliliter. בדרך כלל אנו מדללים את התולעים לריכוז של 1000 תולעים ל-one milliliter. יש להוסיף לתולעים חומצה per chloric בריכוז 60% המכילה epsilon aminocaproic acid כסטנדרט פנימי, עד לריכוז סופי של 4% חומצה per chloric ו-20 nanomolar של הסטנדרט הפנימי.

הניחו לתולעת לשקוע בכוח הכבידה למשך חמש דקות, ולאחר מכן הסירו ושמרו את הנוזל העליון (supernatant) במבחנה אחרת. השלב הבא הוא אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוצדורה זו. יש לפרק את התולעות באופן מלא על ידי סינון לפני ניתוח המטבוליטים החופשיים. בעזרת הומוגנייזר פלסטי ומקדחה ממוטרת, גרסו את דגימות התולעים למשך 15 שניות.

אששו חזותית את פירוק התולעים באמצעות מיקרוסקופיה של אור וחזרו על הטחינה במידת הצורך. בתמונה זו, לוחות A ו-B מציגים תולעים לפני הטחינה. בניגוד ללוחות C ו-D המציגים תולעים לאחר הטחינה, העבירו את העילאי השמור מראש לתוך מבחנות צנטריפוגה פלסטיות של 1.5 מיליליטר עם הומוגנאט התולעים לצנטריפוגה.

סובב את הדגימות במהירות של 2,250 RPM ובכוח של 1300 Gs למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגציה, העבר את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה מזכוכית נקייה בנפח של שבעה מיליליטר. שמור את המשקע (pellet) לשימוש מאוחר יותר בבדיקת ריכוז חלבון.

כעת הוסיפו ארבעה נורמליים של פוטסיום הידרוקסיד ל-SUPERNAT עד שטווח ה-pH של הדגימות יהיה בין שבעה לשמונה. סובבו במ centriuge את הדגימות המנוטרליות בתוך מבחנות זכוכית של שבעה מיליליטר במהירות של 2,250 RPM, בכוח של 1300 Gs, למשך חמש דקות. להסרת מלחים, העבירו את supernatant מכל דגימה למבחנת זכוכית חדשה של שבעה מיליליטר. כעת ניתן להכין את הדגימות המנוטרליות לכימות מטאבוליטים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC) וספקטרומטריית מסה בשילוב כרומטוגרפיה גזית (GCMS). עבור HPLC.

הפרידו 50 µL מכל דגימה מנוטרלת להזרקה ישירה ל-HPLC. כימות חומצות אמינו חופשיות מבוצע באמצעות דריבטיזציה מוקדמת עם אלדהיד וגילוי פלואורסצנטי. כפי שתואר בעבר, שאר הדגימות המנוטרלות יעברו מיצוי באמצעות שרף חילוף יונים עבור GCMS כדי לקבוע העשרה איזוטופית בחומצות אמינו ובחומצות אורגניות, כפי שמוצג בסעיף הבא.

להכנת החרו지를, הוסף חומצה כלורית נורמלית אחת ל-G one ול-G 50 beads בנפרד. בכלי כימיים בנפח של ליטר אחד, ערבב כל בקבוק במשך 30 דקות באמצעות בוחש מגנטי. לאחר מכן, שטוף את החרו지를 במים דה-יוניים 10 פעמים עד שה-pH של מי השטיפה יהיה שווה ל-pH של המים.

בשלב הבא, נציג את שיטתנו להכנת עמודות מותאמות אישית בעלות נמוכה באמצעות פיפטות זכוכית. עמודות מוכנות זמינות גם לרכישה מסחרית. כדי להכין עמודה, השתמשו בפינצטה כדי להחדיר פקק צמר ממש מעל החלק הצר ביותר של קצה פיפטת פסטור; השתמשו בخرזי G 1 למיצוי חומצות אורגניות ובخرזי G 50.

עבור מיצוי חומצות שומנויות, מלאו כל עמודה עד לגובה של כשליש מגובה העמודה. אם הדגימה נמצאת כבר ב-pH ניטרלי, לא מוסיפים לדגימה דבר לפני יישומה על עמודת AG one. כדי למצות חומצות אורגניות לצורך מיצוי חומצות שומנויות, הוסיפו מיליליטר אחד של חומצה כלורית 0.1 normal לדגימה לפני יישומה על עמודת AG 50.

כעת יש להעביר את הדגימות המנוטרלות שהוכנו קודם לכן לכל עמודה. שטפו כל עמודה 10 פעמים במים עד לשטיפות ניטרליות. לאחר סיום השטיפה, בצעו אלוציה מכל עמודה לבקבוקוני דגימה מזכוכית נקיים ומסומנים בנפח 4 ml. לצורך מיצוי חומצות אורגניות, הוסיפו 3 ml של חומצה כלורית בריכוז 3N לעמודת AG 1.

דבר זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופית במספר הכולל של פחמנים מסומנים בקרב מיני פחמן בעלי שלושה פחמנים, ארבעה פחמנים, חמישה פחמנים ושש פחמנים. לצורך מיצוי חומצות אמינו, הוסף שלושה מיליליטרים של ammonium hydroxide בריכוז four normal לעמודת G 50. דבר זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופית במספר הכולל של פחמנים מסומנים בקרב מיני פחמן בעלי שלושה פחמנים וחמישה פחמנים.

עם השלמת מיצויי החומצות האורגניות וחומצות האמינו, העבירו את מבחנות הדגימות למאיץ אידוי (SpeedVac) למשך לילה עד להתייבסותן. לאחר מכן, הדגימות מבודרות ומנותחות באמצעות GCMS כמפורט בטקסט הפרוטוקול. התחילו הליך זה על ידי העברה של אלף תולעים צעירות בשלב הבגרות לצלחת NGM בקוטר 35 מילימטר עבור ניסוי, המכילה גלוקוז מסומן באופן אוניברסלי ב-carbon 13 ו-e coli.

לאחר מכן, הניחו את צלחת ה-NGM הניסויית ללא המכסה שלה בתוך תא זכוכית ייעודי המצויד בברז תלת-דרכי אטום היטב, המאפשר דגימה והחלפה מדויקת של האטמוספירה. כסו את האטם, שבו מונחת דיסקיות הזכוכית השקופה אופטית על הצלחת, בגריס ואקום גבוה.

אטמו את התא באמצעות דיסקת הזכוכית. רשמו את הזמן. כנקודת זמן אפס, 30 דקות לאחר מכן, השתמשו במזרק של 20 מיליליטר כדי לדגום 10 מיליליטר מהאטמוספירה שבתוך תא הזכוכית באמצעות ברז הסטופ তিন-דרך.

סגור את ברז המעבר לתא. לאחר הדגימה, העבר את הדגימה לשפופרת זכוכית ואקום עם פקק אדום המכילה 1 ml של נתרן ביקרבונט ב-0.1 M של נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן, הזרק 10 ml של אוויר לתוך תא הזכוכית דרך ברז המעבר התלת-כיווני. באמצעות מזרק של 20 ml, סגור את ברז המעבר לתא. לאחר הזרקת האוויר מחדש ולפני חידוש האינקובציה, חזור על דגימת האטמוספירה מתא הזכוכית ב-60, 90 ו-120 דקות.

נתחו דגימות אלו של פחמן דו-חמצני אטמוספירי כדי לבחון העשרה של פחמן מסומן באמצעות ספקטרומטר מסות של יחסי גזים כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול; איזוטופים יציבים נקלטו היטב לאחר שעתיים בתולעים בוגרות צעירות, כפי שמעיד כאן הפחמן המסומן שנמדד בפחמן דו-חמצני אטמוספירי ובפחמן דו-חמצני מומס בתולעים שהוזנו ב-OP 50 e coli חיים או כאלו שהושמדו על ידי הקרנת UV. היחס בין פחמן דו-חמצני עם פחמן 13 לפחמן דו-חמצני עם פחמן 12 היה גבוה יותר בחלק של הפחמן דו-חמצני המומס בתולעים ביחס לפחמן דו-חמצני אטמוספירי שהשתחרר. נצפתה חשיפה ממושכת לאיזוטופ יציב החל משלב הזחלים ובשלבים הבאים ניקוי של התולעים ב-NGM Aate ללא חיידקים, אשר העלה את ההעשרה האיזוטופית של גלוטמט חופשי בתולעים בוגרות צעירות.

בגרף זה, L1 מייצג תולעים שהוזנו בגלוקוז מסומן באופן אוניברסלי בפחמן 13 ובחיידקי OP 50 משלב הזחלי L1 ועד לשלב הבוגר הצעיר 959 תאים; YA מייצג תולעים שהוזנו בגלוקוז מסומן בפחמן 13 ובחיידקי OP 50 למשך 48 שעות, החל מהרגע שהגיעו ליום הראשון של השמת ביצים בשלב הבוגר הצעיר. ציר ה-x מציין את המספר הכולל של אטומי פחמן מסומנים בכל סוג של גלוטמט, וציר ה-y מציין את אחוז ההעשרה. כל החיות נקו מתסימן איזוטופי עודף לפני הכנת הדגימות להמשך העבודה.

עבור ניתוחי GCMS, הפסים הירוקים מציינים תולעים שנוקו לאחר חשיפה איזוטופית באמצעות האכלה ב-OP 50 E coli על מצעי NGM למשך שעתיים לפני מיצוי PCA. הפסים הכחולים והאפורים מציינים תולעים שנוקו לאחר חשיפה איזוטופית על מצעי NGM ללא בקטריות למשך שתיים או שש שעות בהתאמה לפני מיצוי PCA, ללא קשר למהלך הזמן של החשיפה האיזוטופית. לא נצפה הבדל משמעותי בהעשרה האיזוטופית של מטבוליטים ביניים כאשר בעלי החיים נוקו על מצעים למשך שעתיים או שש שעות.

בשני מסלולי החשיפה האיזוטופית, נצפתה העשרה איזוטופית נמוכה יותר במטבוליטים ביניים כאשר בעלי החיים נקיים על ידי האכלה בחיידקים שאינם מסומנים במשך שעתיים. לפיכך, נקבע כי פרוטוקול הניקוי האופטימלי עבור תולעים שגודלו על פלטות NGM עם פריסת חיידקים ואיזוטופ הוא ניקוי למשך שעתיים על פלטות NGM ללא פריסת חיידקים, כדי למקסם את אחוז ההעשרה במטבוליטים ביניים. זאת לאחר טיפול של 24 שעות בתרבית נוזלית עם גלוקוז 13C בעל שישה פחמנים ללא חיידקים.

בוצעו השוואות בין דגימות תולעים שעברו דיסרופציה באמצעות סוניקציה בלבד, לבין דגימות שעברו סוניקציה בתוספת טחינה, כפי שמוצג באיור זה. תולעים שעברו סוניקציה בתוספת טחינה הראו העשרה איזוטופית גבוהה יותר מאשר דגימות שעברו סוניקציה בלבד. לבסוף, האכלת תולעים חיות בפרקורסור איזוטופי יציב, בין אם במהלך ההתפתחות משלב L1 על צלחות ובין אם החל מהיום הראשון של הטלת הביצים כבוגרים צעירים למשך 24 שעות בתרבית נוזלית, אפשרה ניתוח רגיש של העשרה איזוטופית בקרב מטבוליטים המעידים על שטף דרך הגליקוליזה ומטבוליזם של פירובט במעגל חומצה הטריקרבক্সילית לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים על מחלות מיטוכונדריאליות במטרה לבחון שטפי חילוף חומרים (metabolic flux) של מטבוליטים ביניים ב-Caenorhabditis elegans. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע פרופיל איזוטופי יציב של מטבוליזם של ביניים ושטף מטבולי בנמטודות מהמין C. elegans.