Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

אלקטרופיזיולוגיה משמשת באופן נפוץ לחקר הפעילות של תעלות יונים רקומיננטיות תלויות-מתח בתאי כליה עובריים של בן אדם בתרבית. הקלטה מוצלחת מחייבת שהתאים יבטא את התעלות ברמות מספיקות בממברנת התא לצורך גילוי, ושהתאים יזרעו בצפיפות תאים נמוכה מספיק כדי לבודד תאים בודדים. ביצוע הקלטות מתאים נבלם לעיתים קרובות על ידי תקופות דגירה ארוכות ב-28 °C הדרושות לביטוי כזה, שבהן חלה בדרך כלל פגיעה בהיצמדות התאים וביציבות הממברנה.

כאן מוצגה שיטה מותאמת עבור תרביות תאים וטרנספקציה העוקפת בעיות אלו. התאים עוברים טרנספקציה ביעילות בינונית, ולאחר מכן מדגרימים בטמפרטורה של 28 °C עד להשגת ביטוי מספק של תעלות יונים. התאים שעברו טרנספקציה נזרעים לאחר מכן על לוחות זכוכית (cover slips) בצפיפות נמוכה ומודגרימים בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים וייצוב של הממברנה.

לאחר מכן, תאים שזריעתם בוצעה כראוי מזוהים באמצעות ביטוי משותף של EGFP ושיטת patch clamp של תא שלם. ניתן לבצע הקלטה, או להדגיר את התאים שוב בטמפרטורה של 28 °C. כדי להגביר עוד יותר את הביטוי של התעלות על פני השטח, תוצאות מניסויי הקלטה בתאים שטרנספקטו עם תעלות סידן תלויות-מתח כגון L CAV one, L CAV two או L cav three מעידות על כך שהתעלות עברו טרנספקציה בהצלחה ובוטאו על ידי התאים.

למרות שמוצגות תוצאות מייצגות עבור L CAV three בלבד, פיתחנו במעבדתנו שיטה להגברת הביטוי של גנים של תעלות יונים בעלי ביטוי נמוך לצורך הקלטות patch clamp בקווי תאים אנושיים. נכון להיום, הגישה המקובלת היא לפצל תחילה את התאים על לוחות כיסוי ולהחדיר באמצעות טרנספקציה cDNA של פלסמידים המכילים את הגנים של תעלות היונים, ולאחר מכן לדגור למשך מספר ימים ב-28 °C כדי להשיג ביטוי יעיל וגבוה של תעלות היונים לפני ההקלטה האלקטרופיזיולוגית. הגישה החדשה שלנו מקצרת באופן משמעותי את זמן הדגירה הנדרש ב-28 °C לפני ההקלטה.

כעת, על ידי קיצור זמן הדגירה ב-28 מעלות, אנו מוצאים כי קרומי התאים יציבים הרבה יותר והתאים שעברו טרנספקציה נצמדים הרבה יותר ללוחיות הזכוכית. דבר זה מגדיל את מספר התאים שניתן להקליט והופך את הניסוי ליעיל באופן משמעותי. לפני הטרנספקציה, פצלו בקבוק מלא בתאי HEK 2 9 3 T שהגיעו למצב של התמסחות מלאה (confluent), ביחס של 1:4, לבקבוק חדש של 25 סנטימטר רבוע, והניחו את התאים באינקובטור ב-37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide.

אפשרו לתאים להיקשר למשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לוודא את ההיקשרות. שימו לב שהתאים כבר אינם נראים עגולים והם נפרסים. שלוחות או פסאודופודיה (pseudopodia) נראות לעין.

תאים בעלי התמזגות (confluence) נמוכה יותר ייראו באופן דומה, אך יהיו מרווחים יותר זה מזה. לאחר שהתאים נצמדו, שלבו את הרכיבים הדרושים לביצוע טרנספקציה סטנדרטית של סידן פוספט. הכינו סך הכל 12 micrograms של DNA ב-600 microliters של תמיסת טרנספקציה לכל בקבוק.

כאן משובטות cDNA של תעלות יונים שונות לתוך הפלסמיד P-I-R-E-S two EGFP. טרנספקציה של וקטור ביטוי זה לסוג תאים של יונקים גורמת לייצור של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) מאותו mRNA של הרצף המשובט, באמצעות תרגום שמתחיל באתר כניסת ריבוזומים פנימי (IRES) הממוקם מיד לאחר רצף הקידוד של תעלת היונים ולפני רצף הקידוד של ה-EGFP. דבר זה מאפשר זיהוי של תאים שעברו טרנספקציה חיובית ללא הפרעה אפשרית בתפקוד החלבון, שעלולה להיגרם מהיתוך ישיר של חלבון ה-EGFP לחלבון המחקרי.

טפטפו את תמיסת הטרנספקציה על התאים, לאחר מכן סובבו בעדינות את הבקבוק והניחו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה. בדקו את יעילות הטרנספקציה על ידי צפייה בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. תאים שעברו טרנספקציה בהצלחה אמורים להיראות בירוק בכל חלקי התא.

לאחר שאישור הטרנספקציה הושג, העבירו בזהירות בעזרת פיפט ארבעה עד חמישה מיליליטרים של מצע חם אל תוך הבקבוק ההפוך. שטפו את התאים על ידי הפיכה איטית של הבקבוק כך ששטח פני התאים יהיה כלפי מטה, וניעור הבקבוק כך שתמיסת השטיפה תעבור על פניהם בעדינות. הסירו את המצע וחזרו על פעולת השטיפה זו.

בצעו את הפעולה פעמיים נוספות. לאחר מכן, הוסיפו שישה מיליליטרים של מצע לבקבוק והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. ביטוי של תעלות יונים של חוליות מציב מספר אתגרים.

ראשית, הם לרוב בעלי גודל גדול ולכן עשויים לדרוש זמן רב לתרגום ברשתית התוך-פלזמית. כמו כן, ייתכן שלא יכוונו ביעילות לממברנת התא בשורת תאים של יונקים. לבסוף, מכיוון שמינים שונים מראים תדירויות שימוש שונות בקודונים, CDNAs הטרולוגיים עשויים להכיל תדירויות גבוהות של קודונים שאינם נפוצים בתאי יונקים כגון HEK 2 9 3 T כדי להתגבר על חלק מקשיים אלו.

לאחר דגירה של שעתיים ב-37 degrees Celsius בעקבות שטיפת התרחיל, העבירו את הבקבוקים למדגרה ב-28 degrees Celsius למשך יומיים עד שישה ימים כדי להאריך את תקופת הביטוי. יש לקבוע את זמן הדגירה באופן אמפירי עבור כל סוג של תעלת יונים המובעת. זאת מאחר שדגירה ב-28 degrees Celsius למשך פרקי זמן ממושכים מובילה להיסגרות של התאים וליציבות ממב ferrite נמוכה.

נדרשת הכנה נוספת של התאים לפני ביצוע מחקרים אלקטרופיזיולוגיים. ראשית, הסר את המצע מהתאים שעברו טרנספקציה באמצעות פיפטת שאיבה, והחדל מיליליטר אחד של תמיסת trypsin בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לתוך בקבוק הפוך. לאחר מכן, החזר בעדינות את הבקבוק למצב שבו פיית הבקבוק פונה כלפי מטה אל פני התאים, כדי לאפשר ל-trypsin לזרום בעדינות על התאים.

הפוך את הבקבוק חזרה והסר את ה-trypsin. לאחר מכן, הוסף 250 µL של trypsin חם ישירות על התאים והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות, עד שהתאים ינשלו. בינתיים, הנח שלוש עד שמונה כיסויות זכוכית (coverslips) מצופות poly L lysine לתוך צלחת תרבית של 60 mm והוסף 5 mL של מצע גידול חם.

לאחר שהתאים התנתקו, השהה אותם בארבעה מיליליטר של מצע חמים על ידי פיפוט מעלה ומטה כשישה פעמים. לאחר מכן, בעזרת קצה המיקרו-פיפט, לחץ על לוחות הכיסוי כדי לוודא שהם נמצאים בתחתית הצלחת. לאחר מכן, הוסף 250 עד 500 µL של תאים שהושהו. הדגר את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות כדי לאפשר להם להיצמד ללוחות הכיסוי.

השארת התאים למשך זמן רב מדי בטמפרטורה של 37 מעלות תוביל לחלוקת תאים ולדילול של הפלסמידים שעברו טרנספקציה. יש לזרע את התאים שעברו טרנספקציה בצפיפות נמוכה מספיק כדי שיהיו מבודדים זה מזה, כפי שמוצג כאן. דבר זה יקל על ההקלטה האלקטרופיזיולוגית.

עבור תאים הדורשים תתי-יחידות עזר, לעיתים קרובות יש להעביר את התאים ל-28 degrees Celsius ולהדגיר אותם למשך שלושה עד ארבעה ימים נוספים לפני ביצוע בדיקה אלקטרופיזיולוגית. עבור תאים שאינם דורשים תתי-יחידות עזר, ניתן לבצע את ההקלטה מיד לאחר הדגירה זו.

מתקן האלקטרופיזיולוגיה שנעשה בו שימוש כאן כולל מגבר, מניפולטורים ממונעים לשתי פיפטות, מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) ומערכות פרפוזיה. הציוד הותקן על שולחן בידוד רעידות, ורעשים חשמליים חיצוניים מוגבלים על ידי כלוב פראדיי (Faraday cage) מסוג 2 בגובה 40 אינץ'. מערכות הבקרה האלקטרוניות כוללות מחשב המצויד ב-Digitron 1440, ממשק ממיר מאנלוגי לדיגיטלי, בשילוב עם תוכנת P clamp 10.1.

מגבר מסך המחשב, המניפולטור הממוטור and מערכת בקרת זרימה של קישורי שסתומים מותקנים כולם מחוץ לכלוב פאראדיי. על גבי מדף חשמל מתכתי בודד בגודל 19 אינץ', כל הציוד החשמלי מוארק למפצל נחושת ומחובר לשנאי בידוד בדרגה רפואית, המספק בידוד קווי, הארקה עקבית והגנה מפני נחשולי מתח. הכינו את הניסויים על ידי התקנת מיקרו-פיפטות מלוטשות באש בעלות התנגדות של two to five mega ohms על תושבת המיקרו-פיפטות בראש הבמה.

ממלאים את פיפטות ה-patch בתמיסה פנימית, נקישים עליהן להסרת בועות אוויר ובסוף מרכיבים אותן על ה-head stage. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, מעבירים לוחות כיסוי אחד עם תאים שנשתלו לצלחית פטרי פלסטית של 35 מילימטר המכילה 3 מיליליטר של תמיסת הקלטה חיצונית בטמפרטורת החדר. יש למדוד את נפח תמיסת ההקלטה במדויק בעת ביצוע ניסויי תרופות, שבהם מוסיפים לצלחית כמויות ידועות של תרופה באמצעות מיקרו-פיפטה; מניחים את הצלחית עלבמת המיקרוסקופ.

לאחר מכן, מלאו חצי תא של מחזיק מיקרו-אלקטרודה ב-cesium chloride בריכוז של three molar. לאחר מכן, הכניסו את אלקטרודת הייחוס אל חצי התא והניחו את אלקטרודת ההארקה בתוך האמבט באמצעות המיקרו-מניפולטור, והורידו את פיפטת הפאץ' אל תוך תמיסת האמבט. הדמינו את התאים במצב פלואורסצנציה ומרכזו תא ירוק דביק, מבודד ומעובד חיובית (positively transfected), במרכז שדה הראייה.

בעודכם במצב אמבט (bath mode), קרבו את פיפט הפאץ' (patch pipette) לסמיכות לתא. אפסו את עקב גל הריבוע הנצפה על מסך המחשב. כוון את מיקום פיפט הפאץ' כך שיגע רק בתא, ועד שעקב זרם הריבוע על המסך יתחיל להתנודד.

יש להפעיל שאיבה עדינה באמצעות מזרק מחובר עד להשגת אטימה ברמת giga ohm. לאחר שהושגה אטימה ברמת giga ohm, יש להעביר את התוכנה למצב patch. יש להפעיל פולס שאיבה מהיר עם המזרק כדי לפרוץ את ממברנת התא.

לאחר מכן, עברו למצב תא (cell mode) והשתמשו בפרמטרים של תא שלם במגבר. כדי לפצות על תגובה קיבולית חולפת (capacitive transient), יש להמתין לשיווי משקל של ה-patch כך שתמיסת ההקלטה התו-תאית תדיאליז לתוך התא שנבחר. הזינו כאן את פרוטוקולי מתח ה-voltage clamp שנכתבו עבור ניסוי זה.

הנסיין תכנן פרוטוקול למדידת זרמי יונים דרך תעלות יונים תלויות-מתח, הנוצרים כאשר המתח על פני קרום התא משתנה. במקרה זה, אנו בוחנים פרוטוקול IV הקובע כי התוכנה תשמור את התא במתח החזקה של 110- מיליוולט, ולאחר מכן תבצע קפיצה (SEP) למתח של 70- מיליוולט למשך 250 מילישניות. לאחר מכן, המתח יחזור למתח ההחזקה של 110- מיליוולט. בכל פעם, גובה הקפיצה יעלה ב-10 מיליוולט, כך שהקפיצות יהיו ל-70- מיליוולט, 60- מיליוולט, וכן הלאה, עד שהקפיצה האחרונה תהיה ל-20+ מיליוולט.

סננו את הזרמים המוקלטים ב-10 kilohertz באמצעות מסנן Bessel Lowpass במגבר, ובצעו דיגיטציה בתדר דגימה של שני kilohertz באמצעות תוכנת clamp X 10.1; השתמשו רק בהקלטות עם דליפה מינימלית, פחות מ-10%. לצורך הניתוח, תאי HEK 2 93 T גודלו והועברו להם (transfected) L Cav. שלושה תעלות סידן כפי שמוצג כאן. טרנספקציה מוצלחת של cDNA של תעלות יונים הטרולוגיות סומנה על ידי פלואורסצנציה שנוצרה מווקטור P-I-R-E-S two eeg FP.

כאן אנו מראים ביטוי מוצלח של תעלה סידן מסוג cav three של חסרי חוליות. כאשר התאים אינם טרנספקטומים, לא ניתן לעורר זרמי סידן. לעומת זאת, תאים טרנספקטומים מייצרים זרמים גדולים כאשר מיושמים על התאים פרוטוקולי voltage clamp של תא שלם.

חוקרים יכולים להשתמש בתנאים אלקטרופיזיולוגיים ובמשטרי ניתוח נתונים שונים בהתאם לדרישותיהם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בשיקול דעתכם בנוגע לתזמון הניסויים. מכיוון שתעלים שונות מובעות ביעילויות שונות בממברנת התא, הבחירה באסטרטגיה האופטימלית להגברת חיוניות התאים וכן למקסום הביטוי על פני השטח של התעלים שבהם אתם מעוניינים נתונה לשיקול דעתכם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שרכשתם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לתרבת ולתחזק שורת תאים אנושית, וכן כיצד לבצע טרנספקציה של CDNAs של תעלות יונים הטרולוגיות ו-CDNAs של תת-יחידות לתאים אלו, לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.