מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

נגיפי אלפא (Alpha viruses) הם נגיפי RNA המועברים על ידי יתושים, המדביקים תאי יתוש רגישים באופן מתמיד עם פתולוגיה תאית מינימלית. פרוטוקול זה מדגים את התועלת של מערכות העברה (transducing systems) של נגיפי אלפא זיהומיים המבטאים חלבונים פלורסצנטיים לצורך זיהוי הדבקה של הווקטור והעברה של הנגיף. ראשית, האכילו נקבי יתושים בארוחת דם המכילה את נגיף האלפא הרלוונטי, לאחר מכן קבעו את יעילות ההדבקה של היתושים, ובחרו רק יתושים המבטאים את הגן המסמן.

בשלב הבא, אספו רוק מהיתושים המודבקים והדגימו את יכולת ההדבקה על ידי הדבקת תאי יתוש בתרבית באמצעות הרוק שנאסף. התוצאות התקבלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi-fluorescent microscopy). הדמיאן של חלבון דמוי GFP מאפשר לעקוב אחר ההדבקה של הווקטור והעברת הנגיף על ידי מיני יתושים מסוג eighties או QE.

ניתן להשתמש במערכות ביטוי של נגיפי אלפא (Alpha virus expression systems) או ATSs להערכה מהירה של ביטוי גנים ושל פיתוחי יתושי וקטור, הן לצורך מחקרי ארבּו-וירוס (arbovirus) והן לפני ביצוע מניפולציות מורכבות יותר ביתושים, כגון טרנסגנזיס של יתושים. את הפרוצדורות הללו ידגימו ד"ר Irma Sanchez Vargas, ד"ר Eric Mossel ואהרון פיליפס מהמעבדה של ד"ר Ken Olson. כדי לייצר נגיף TS בתאי Bhk 21, השתמשו בנגיף רקומביננטי סימביוטי המבטא את הדיווח GFP לאחר תמלול חוץ-תאי (in vitro transcription), והעבירו באמצעות אלקטרופורזה את ה-RNA של מערכת ההעברה הגנומית של נגיף האלפא אל תוך תאי bhk 21.

לאחר מכן, הצילו והשכילו את הנגיף לפני ההדבקה. הכינו את היתושים להזנה יעילה בדם ממזין מלאכותי באמצעות הרעבה. הסירו את הסוכר 24 שעות לפני ההזנה ואת המים 12 שעות לפני ההזנה.

ערבבו דם בעלי חיים שנרכש מסחרית, דפיברילי או ציטראטי, עם תרבית תאים שהוכנה כדי להפיק תרחיף של נגיף TS להדבקה יעילה של המעי האמצעי של היתושים. הגדירו תיתור נגיפי של 10⁷ יחידות יוצרות פלאק למיליליטר עבור ארוחת הדם כדי לעודד את היתושים להיגמר. הוסיפו TP לריכוז סופי של 0.02 molar.

הניחו ממбраנה מעיית בעלת נקבים מעל פתח של המזין הזכוכית בעל מעטפת מים. לאחר מכן, הכינו את המזינים עם מים במחזוריות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, פפטו את הארוחה לתוך התא והניחו את המזינים בצורה מאובטחת על גבי הקרטון.

לאחר האכלת הפיתוחיים למשך 10 עד 30 דקות, מיין את הפיתוחיים שהורדמו בקור כדי לבודד את הדגימות ששבעו דם, זאת כדי לאפשר שכפול והפצה של נגיף TS בפיתוחיים הנבחרים. דגור אותם בטמפרטורה של 28 °C ובלחות יחסית של 75% למשך שמונה עד 10 ימים. זאת על מנת לנייד את הפיתוחיים.

הניחו את קופסת הנייר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות. כעת, העבירו חמישה עד 10 יתושים לשולחן קירור המותאם לשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בחנו ומיינו את היתושים על סמך נוכחות או היעדר פלואורסצנציה.

החזירו את הפקידים שנבחרו לקרטון הנייר לשימוש לפי הצורך. בנקודה זו, קבעו את יעילות ההדבקה תוך שימוש בעוצמת הפלורסצנציה כמדד עקיף (proxy). לבסוף, בצעו דיסקציה של רקמות כגון המעיים האמצעיים, בלוטות ה-SIV וגופי השומן, ועקבו אחר פלורסצנציה.

ניתן לבצע נתיחה של איברים ורקמות אלו במועדים מוקדמים יותר במידת הצורך. יש למנוע מהיתושים גישה למקור סוכר במשך 24 שעות לפני ההזנה. הכינו צינור קפילרי בנפח 50 µL שעבר חימום, מתיחה וחיתוך, ומלאו אותו ב-3 עד 5 µL של Cargill.

הסב שמן טבילה מסוג B כדי להבטיח שהיתושים לא יברחו. הסר את הרגליים והכנפיים שלהם. כעת הכנס את ה-proboscis אל תוך המבחנה.

עקבו בקפידה אחר טיפות הרוק המהוללות מהחרטום אל תוך שמן הטבילה. במידת הצורך, הניחו טיפה של 1% pilocarpine על חזה היתוש כדי להגביר את ההרצעה. לאחר 60 עד 90 דקות, הסירו את היתושים ואחסנו אותם לצורך בידוד נגיפים בעתיד. כעת, כדי לאסוף את התמיסה מצינור הנימיות, דחפו את תערובת הרוק והשמן אל תוך מבחנה המכילה 500 µL של 20% F-B-S-P-B-S סטרילי.

סננו את האינוקולום באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרון, ולאחר מכן השתמשו באינוקולום זה כדי להדביק תאי יתוש בתרבית. יעילות ההדבקה עם נגיף five prime DS MRE 16 GFP מוערכת על ידי ביטוי של GFP. לאורך זמן, תאים אלו הודבקו בנגיף בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של 0.01.

מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי מאפשר תצפית על כל הגוף של ה-GFP ביתוש הנגוע, וכן בחלקיו השונים של הגוף, כאן ביום ה-10 לאחר ההדבקה. ביטוי סלקטיבי של GFP באיברים מעיד על זיהום מפושט. במעיים האמצעיים מופיעים בדרך כלל מוקדי זיהום מובחנים זמן קצר לאחר בליעת ארוחת דם המכילה נגיף, אשר מתפשטים לכל רחבי החלק האחורי של המעי האמצעי במועדים מאוחרים יותר לאחר ההדבקה.

אירועים אלו מסומנים על ידי רפורטרים של GFP ו-DS RED. בדיקת ההעברה מעידה כי נגיף DS MRE 16 GFP בעל חמישה פריימרים מבטא GFP באופן יציב לאורך כל תקופת הדגירה החיצונית. ביתוש זה, GFP ורוק יתוש מזוהים כבר שמונה ימים לאחר ההדבקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדביק יתוש בנגיף A TS באופן אוראלי, כיצד להעריך חזותית זיהום נגיפי ביתוש, וכיצד להעריך את העברת הנגיף מהיתוש.